Summary

طريقة بسيطة وغير مكلفة لتحديد الباردة الحساسية والتكيف في الفئران

Published: March 17, 2015
doi:

Summary

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 °C and 5 °C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Abstract

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.

Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 °C to 5 °C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.

This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Introduction

قياس الاستجابة الباردة في القوارض المهم لتحسين فهم الآليات المحتملة للحساسية الباردة في البشر في إطار كل من الظروف العادية والمرضية. والباردة أخمصي الفحص (CPA)، وضعت أصلا منذ عدة سنوات يهدف إلى توليد استنساخه، لا لبس فيها الاستجابات السلوكية الفئران لحافز البارد ألقاها في RT. وقد أتاحت المزيد من التحسينات الأخيرة من هذا الاختبار قياس استنساخه من حساسية الباردة في مجموعة واسعة من درجات الحرارة 2. تم تصميم كلا الإصدارين أيضا أن يكون نسبيا عالية الإنتاجية، وغير مكلفة للاستخدام.

أحرز قدر كبير من التقدم في فهم آليات حساسية الباردة باستخدام أساليب سلوكية أخرى. أسلوب واحد هو اختبار التبخر الأسيتون، والتي تنطوي على اللمس أو الرش الأسيتون على مخلب الماوس وقياس مقدار الوقت الذي تنفق الماوس عبها 3،4 مخلب. للأسف،خزينا الردود على الأسيتون التبخر التي كتبها الإحساس الرطب ورائحة الأسيتون. أيضا، والتحفيز الباردة التي يتم تطبيقها في اختبار الأسيتون التبخر يمكن أن تختلف على أساس كمية من الاسيتون التطبيقية، ويصعب قياسها كميا. وأخيرا، لم يصب الفئران لها ردود الحد الأدنى لالأسيتون في الأساس، مما يجعل من المستحيل قياس التسكين في غياب فرط الحساسية مع هذا الأسلوب.

فحص الكلاسيكي آخر لردود الباردة هو فحص الذيل نفض الغبار، حيث يتم قياس زمن الوصول إلى الانسحاب بعد مغمورة الذيل في 5،6 الماء البارد. في حين أن الاستجابات السلوكية في هذا الاختبار هي لا لبس فيها ويقيس الفحص الردود على درجة حرارة معينة، لا بد من ضبط النفس الحيوانات أثناء الاختبار، والتي يمكن أن تغير الاستجابة الباردة من خلال موصوفة وصفا جيدا التوتر الناجم عن آليات مسكن 7.

آخر أداة تستخدم عادة هي اختبار لوحة البارد، الذي يقيس السلوكيةردود الفئران بعد يتم وضعها على طبق من ذهب المبردة بلتيير 8-10. بينما توفر هذه الأداة المعلومات حول استجابات الحيوان في درجات حرارة معينة، فإنه كما استخدمت بشكل غير متسق. وتقاس مجموعات مختلفة أنواع مختلفة من الاستجابات بما في ذلك عدد من القفزات 8،11، الكمون لأول رد 8،11- 13، وعدد من مخلب يرفع 11،13،14 مع نتائج مختلفة جدا. لوحة فحص البارد هو أيضا منخفضة نسبيا الإنتاجية كما حيوان واحد فقط يمكن اختبارها في كل مرة، وأنه يتطلب وجود جهاز بلتيير مكلفة وهشة.

2-لوحة اختبار تفضيل درجة الحرارة هو مشتق تستخدم عادة للاختبار لوحة الباردة يقيس كمية النسبي من الوقت الذي تنفق الحيوانات في 2 وحات متصلة من درجات حرارة مختلفة 9،15- 17. آخر مماثل فحص شيوعا هو فحص التدرج الحراري، حيث مقدار الوقت الذي تنفق الفئران في مناطق مختلفة في درجة الحرارةتتراوح بين 5 ° C و 45 ° C على لوحة معدنية طويلة تقاس 16. في حين أن هذه المقايسات تسمح المقارنة بين درجات الحرارة، وأنه من غير الواضح ما إذا كان يمثل سلوك النفور درجة الحرارة أو لتفضيل درجة الحرارة.

وأخيرا، تم استخدام لوحة الباردة الديناميكي فحص لقياس مدى الفئران تستجيب لتغير درجات الحرارة المحيطة 18. يتضمن هذا الأسلوب وضع الفئران على جهاز بلتيير RT والتعلية ذلك وصولا الى 1 درجة مئوية في حين قياس مدى تقفز الفئران أو لعق الكفوف في درجات حرارة لوحة مختلفة. في حين أن هذا اختبارات كيف الفئران على التكيف مع بيئة التبريد، وأنها لا توفر وسيلة لاختبار مدى الفئران تستجيب لحافز البارد في الإعداد لدرجة الحرارة المحيطة برودة. بالإضافة إلى ذلك، فإنه يتطلب معدات باهظة الثمن لأداء ولا توفر وسيلة لتأقلم الفئران لاختبار المعدات قبل قياس حساسيتها الباردة.

واستكمالا لهذه المقايسات، وCPA يختبر acclimaردود تيد لحافز البارد واضحة المعالم في مجموعة متنوعة من تتراوح درجة الحرارة، أو أثناء عملية التكيف مع درجات الحرارة المحيطة الباردة. فإنه يمكن اختبار ما يصل الى 14 الفئران في وقت واحد مع الجهاز الحالي لدينا، مع إمكانية زيادتها غير مكلفة تصل لاختبار الإنتاجية العالية.

Protocol

وكانت جميع البروتوكولات الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة من قبل لجنة الدراسات الحيوانية من كلية الطب بجامعة واشنطن (سانت لويس، MO). 1. إعداد لوحة اختبار واسوار <li style=";text-alig…

Representative Results

الاستجابات السلوكية انتزع من الفئران ابتداء من الساعة 30 ° C، 23 ° C، 17 ° C، و 12 ° C هي تكرار للغاية (الشكل 4A) 20. من أجل قياس التحفيز الباردة التي يتم توليدها تحت hindpaw، تم تخدير الفئران مع الكيتامين / زيلازين / آسيبرومازين الكوكتيل وتم تأمين الكفوف على الزجاج ع?…

Discussion

The CPA can be used to assess cold sensitivity and cold adaptation in mice. It provides an affordable, efficient way to measure cold responses in unrestrained, acclimated animals at a wide variety of temperature ranges. It also provides an unambiguous behavioral response with an easily quantified and analyzed output variable. It has already been used to assess changes in cold sensitivity induced by inflammation1, neuropathic injury1, analgesics1, genetic knockouts20, and ge…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge contributions from the entire Gereau Lab for manuscript editing. This work is supported by NINDS funds 1F31NS078852 to DSB and NINDS fund NS42595 to RWG.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T-type thermocouple probe Physitemp IT-24p Used to measure the surface temperature of the glass (http://www.physitemp.com/products/probesandwire/)
Glass plate Local glass company (in St. Louis, Stemmerich Inc) N/A We use pyrex glass (borosilicate float). Our lab generally uses 1/4'', but 3/16'' and 1/8'' are also useful
Thermal Data logger Extech EA15 Thermologger to keep track of glass temperature (http://www.extech.com/instruments/product.asp?catid=64&prodid=408)
3mL Syringe BD 309657 The top is cut off, and dry ice is compressed in the syringe to generate a cold probe
Computer If using Extech logger, any Pcwill work N/A
Aluminum boxes Washington University in St. Louis machine shop N/A boxes are 3' long, 4.5'' wide, and 3'' tall with a sealed lid.  There is a 1/2'' hole drilled into one short side of each box, near the bottom. These holes are filled with rubber stopcocks when the boxes are filled with wet ice or hot water.
Heated water circulator VWR Any water circulator model with a pump will work
21 gauge needle BD 305165 The exact needle size is not important
Hand timer N/A Any hand timer will work
Mirror N/A Any flat mirror will work

References

  1. Brenner, D. S., Golden, J. P., Gereau, R. W. A Novel Behavioral Assay for Measuring Cold Sensation in Mice. Plos ONE. 7 (6), 8 (2012).
  2. Brenner, D. S., Vogt, S. K., Gereau, R. W. A technique to measure cold adaptation in freely behaving mice. Journal of Neuroscience Methods. , (2014).
  3. Choi, Y., Yoon, T. W., Na, H. S., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral signs of ongoing pain and cold allodynia in a rat model of neuropathic pain. Pain. 59 (3), 369-376 (1994).
  4. Gauchan, P., Andoh, T., Kato, A., Kuraishi, Y. Involvement of increased expression of transient receptor potential melastatin 8 in oxaliplatin-induced cold allodynia in mice. Neuroscience letters. 458 (2), 93-95 (2009).
  5. Carlton, S. M., Lekan, H. A., Kim, S. H., Chung, J. M. Behavioral manifestations of an experimental model for peripheral neuropathy produced by spinal nerve ligation in the primate. Pain. 56 (2), 155-166 (1994).
  6. Pizziketti, R. J., Pressman, N. S., Geller, E. B., Cowan, A., Adler, M. W. Rat cold water tail-flick: A novel analgesic test that distinguishes opioid agonists from mixed agonist-antagonists. European Journal of Pharmacology. 119 (1-2), 23-29 (1985).
  7. Pinto-Ribeiro, F., Almeida, A., Pego, J. M., Cerqueira, J., Sousa, N. Chronic unpredictable stress inhibits nociception in male rats. Neuroscience letters. 359 (1-2), 73-76 (2004).
  8. Karashima, Y., et al. TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (4), 1273-1278 (2009).
  9. Knowlton, W. M., Bifolck-Fisher, A., Bautista, D. M., McKemy, D. D. TRPM8, but not TRPA1, is required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in vivo. Pain. 150 (2), 340-350 (2010).
  10. Allchorne, A. J., Broom, D. C., Woolf, C. J. Detection of cold pain, cold allodynia and cold hyperalgesia in freely behaving rats. Molecular pain. 1, 36 (2005).
  11. Colburn, R. W., et al. Attenuated cold sensitivity in TRPM8 null mice. Neuron. 54 (3), 379-386 (2007).
  12. Dhaka, A., Murray, A. N., Mathur, J., Earley, T. J., Petrus, M. J., Patapoutian, A. TRPM8 is required for cold sensation in mice. Neuron. 54 (3), 371-378 (2007).
  13. Bautista, D. M., et al. The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold. Nature. 448 (7150), 204-208 (2007).
  14. Obata, K., et al. TrpA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after inflammation and nerve injury. The Journal of Clinical Investigation. 115 (9), 2393-2401 (2005).
  15. Tang, Z., et al. Pirt functions as an endogenous regulator of TRPM8. Nature communications. 4, 2179 (2013).
  16. Lee, H., Iida, T., Mizuno, A., Suzuki, M., Caterina, M. J. Altered thermal selection behavior in mice lacking transient receptor potential vanilloid 4. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (5), 1304-1310 (2005).
  17. Pogorzala, L. A., Mishra, S. K., Hoon, M. A. The cellular code for Mammalian thermosensation. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (13), 5533-5541 (2013).
  18. Yalcin, I., Charlet, A., Freund-Mercier, M. -. J., Barrot, M., Poisbeau, P. Differentiating thermal allodynia and hyperalgesia using dynamic hot and cold plate in rodents. The journal of pain official journal of the American Pain Society. 10 (7), 767-773 (2009).
  19. Callahan, B. L., Gil, A. S., Levesque, A., Mogil, J. S. Modulation of mechanical and thermal nociceptive sensitivity in the laboratory mouse by behavioral state. The journal of pain: official journal of the American Pain Society. 9 (2), 174-184 (2008).
  20. Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Dhaka, A., Story, G. M., Gereau, R. W. A dynamic set point for thermal adaptation requires phospholipase C-mediated regulation of TRPM8 in vivo. Pain. , (2014).
  21. Patwardhan, A. M., Scotland, P. E., Akopian, A. N., Hargreaves, K. M. Activation of TRPV1 in the spinal cord by oxidized linoleic acid metabolites contributes to inflammatory hyperalgesia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18820-18824 (2009).
  22. Fujita, F., Uchida, K., Takaishi, M., Sokabe, T., Tominaga, M. Ambient Temperature Affects the Temperature Threshold for TRPM8 Activation through Interaction of Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate. Journal of Neuroscience. 33 (14), 6154-6159 (2013).
  23. Rohacs, T., Lopes, C. M., Michailidis, I., Logothetis, D. E. PI(4,5)P2 regulates the activation and desensitization of TRPM8 channels through the TRP domain. Nature neuroscience. 8 (5), 626-634 (2005).
  24. Daniels, R. L., Takashima, Y., McKemy, D. D. Activity of the neuronal cold sensor TRPM8 is regulated by phospholipase C via the phospholipid phosphoinositol 4,5-bisphosphate. The Journal of biological chemistry. 284 (3), 1570-1582 (2009).
  25. Zhang, H., et al. Neurokinin-1 receptor enhances TRPV1 activity in primary sensory neurons via PKCepsilon: a novel pathway for heat hyperalgesia. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (44), 12067-12077 (2007).
  26. Wang, H., Zylka, M. J. Mrgprd-expressing polymodal nociceptive neurons innervate most known classes of substantia gelatinosa neurons. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (42), 13202-13209 (2009).

Play Video

Cite This Article
Brenner, D. S., Golden, J. P., Vogt, S. K., Gereau IV, R. W. A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice. J. Vis. Exp. (97), e52640, doi:10.3791/52640 (2015).

View Video