Eenvoudige-Polyacrylamide gebaseerde Multiwell Stiffness Assay voor de Studie van stijfheid-afhankelijke cel responsen
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
De meeste lichaamsweefsels zijn zacht visco-elastisch materiaal met een elasticiteitsmodulus van 0,1 kPa hersenen 100 kPa zachte kraakbeen, maar de meeste in vitro-onderzoek verricht naar weefselkweek polystyreen (TCP) dat een modulus van ~ 1 GPa heeft . 1 Deze stijfheid mismatch grote invloed op de manier waarop cellen reageren op hun omgeving. Een groeiende hoeveelheid onderzoek is dus gewijd aan het ophelderen van het effect van substraat stijfheid over het lot van verscheidene celtypen, waaronder 2,3 stamcellen. 4 Daardoor zijn verschillende hydrogels ontwikkeld om te helpen bij het begrijpen van stijfheid-afhankelijke cellijn biologie waaronder polyacrylamide (PA), 5-7 polyethyleenglycol (PEG), 8,9 polydimethylsiloxaan (PDMS), 10 en alginaat. 11 Hoewel het bewijs dat substraat stijfheid heeft een aanzienlijke impact op de lot van de cel groeit, de meeste studies zijn uitgevoerd op kleine schaal met een klein aantal jarenamples. Systematische, multidimensionale studies naar het effect van substraat stijfheid voor een serie van celtypen of milieuomstandigheden zijn zeldzaam. 12
Verscheidene veelbelovende high-throughput hydrogel technieken ontwikkeld, zoals PEG-gebaseerde microarrays, 13 microfluïdische inrichtingen voor de productie van agarose hydrogel microbolletjes, 14 of micro- en nano-stangen waar stijfheid wordt gemoduleerd door de diameter en hoogte van de microrods. 15 Nochtans , de technologieën voor te bereiden dergelijke substraten zijn verfijnde en beschikbaar voor een beperkt aantal laboratoria. Veel onderzoek met stijfheid gemoduleerd celresponsen gebruik polyacrylamide (PA) gels die niet alleen goedkoop en eenvoudig te implementeren, maar vertonen ook een fysiologisch relevant bereik van Young's modulus, namelijk 0,3 -. 300 kPa 16-22 De bestaande werkwijzen te vervaardigen PA gels voor celcultuur zijn arbeidsintensief en dus prepared in kleine batches. Enkele moeilijkheden bij de bereiding van PA gels celsubstraten voort uit het vereiste dat de gels worden bereid: 1) in afwezigheid van zuurstof om volledige polymerisatie mogelijk, 2) met een vlakke oppervlakte uniforme cel toe hechting en verspreiding, en 3) vast aan de onderkant van de celkweekschaal te voorkomen drijven.
Verschillende groepen hebben geprobeerd om PA gels voor celcultuur te produceren in grote batches. Semler et al. Bereide dikke vellen PA gels waarvan vervolgens "cut" met een perforator en geplaatst in 96-well platen. 23 Deze methode is beperkt tot stijver gels, namelijk> 1 kPa in Young's modulus, want zachter gels zijn "sticky", moeilijk te snijden en gemakkelijk beschadigd. Mih et al. Ontwikkelden een meer geavanceerde techniek waardoor de gels rechtstreeks worden gepolymeriseerd glazen bodem multi- putjesplaat. <sup> 6 Dit werd bereikt door het gieten van de gel-oplossingen in gefunctionaliseerde glas-bodemplaten en de vorming van gels door "sandwichen" ze met een aangepaste dekglaasje array. 6 Hoewel veelbelovend, lichte voorsprong effecten werden nog waargenomen met deze techniek. Daarnaast is de techniek vereist een speciaal ontworpen matrix niet onmiddellijk door veel laboratoria en kostbare glazen bodem putjes.
Dit artikel beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om PA gels monteren in een plaat met meerdere putjes die door elk laboratorium gemakkelijk kunnen worden vastgesteld. Hier wordt een flexibele kunststof gebruikte drager, die twee kanten heeft – een hydrofoob is, dat afweermiddel voor PA gels, en een hydrofiele, die covalent bindt PA gel op afzetting. Zodra PA gel platen worden gedeponeerd en permanent aangebracht op de flexibele kunststof steun, maakt het hanteren van gels van elke dikte of stijfheid en snij ze in elke gewenste vorm. Dit ca.oach produceert niet alleen de aangepaste plastic 'coverslips' in de maten anders niet in de handel verkrijgbaar, maar voorkomt ook de noodzaak om glasoppervlakken-treat pre, ofwel dekglaasjes of de putten van dure glazen bodem putjes, met een PA binding oplossing, dat is een vervelende en tijdrovende stap. Tenslotte kan uniform PA gels platen worden bereid in grote series en opgeslagen de gehydrateerde enkele maanden.
Kortom, de assay hier gepresenteerde is een verbetering over bestaande werkwijzen in verschillende aspecten. Ten eerste, het proces van multi-putjesplaat samenstel efficiënt, en de totale kosten van de benodigde materialen is laag. Ten tweede worden de hydrogelen in grote batches in een homogene gel film. Tenslotte uitsluitend materialen die commercieel verkrijgbaar zijn vereist. De bruikbaarheid van de test wordt geïllustreerd door onderzoeken van het effect van substraat stijfheid op celmorfologie en verspreidingsgebied.
Protocol
Representative Results
Discussion
Polyacrylamide gels, oorspronkelijk ontwikkeld voor elektroforese, 28 worden nu routinematig gebruikt als celkweek substraten om de effecten van substraat stijfheid op celmorfologie, beweeglijkheid en communicatie 3,24,29 onder celeigenschappen bestuderen. Polyacrylamide staat manipulatie substraat stijfheid om de stijfheid van alle zachte weefsels in het lichaam omvatten (0,3-300 kPa) 1 met een eenvoudige verandering in polymeervoorloper concentratie (Figuur 2, Tabel 1,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino … [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -. M., Wang, H. -. B., Dembo, M., Wang, Y. -. l. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. . The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
