Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
De meeste lichaamsweefsels zijn zacht visco-elastisch materiaal met een elasticiteitsmodulus van 0,1 kPa hersenen 100 kPa zachte kraakbeen, maar de meeste in vitro-onderzoek verricht naar weefselkweek polystyreen (TCP) dat een modulus van ~ 1 GPa heeft . 1 Deze stijfheid mismatch grote invloed op de manier waarop cellen reageren op hun omgeving. Een groeiende hoeveelheid onderzoek is dus gewijd aan het ophelderen van het effect van substraat stijfheid over het lot van verscheidene celtypen, waaronder 2,3 stamcellen. 4 Daardoor zijn verschillende hydrogels ontwikkeld om te helpen bij het begrijpen van stijfheid-afhankelijke cellijn biologie waaronder polyacrylamide (PA), 5-7 polyethyleenglycol (PEG), 8,9 polydimethylsiloxaan (PDMS), 10 en alginaat. 11 Hoewel het bewijs dat substraat stijfheid heeft een aanzienlijke impact op de lot van de cel groeit, de meeste studies zijn uitgevoerd op kleine schaal met een klein aantal jarenamples. Systematische, multidimensionale studies naar het effect van substraat stijfheid voor een serie van celtypen of milieuomstandigheden zijn zeldzaam. 12
Verscheidene veelbelovende high-throughput hydrogel technieken ontwikkeld, zoals PEG-gebaseerde microarrays, 13 microfluïdische inrichtingen voor de productie van agarose hydrogel microbolletjes, 14 of micro- en nano-stangen waar stijfheid wordt gemoduleerd door de diameter en hoogte van de microrods. 15 Nochtans , de technologieën voor te bereiden dergelijke substraten zijn verfijnde en beschikbaar voor een beperkt aantal laboratoria. Veel onderzoek met stijfheid gemoduleerd celresponsen gebruik polyacrylamide (PA) gels die niet alleen goedkoop en eenvoudig te implementeren, maar vertonen ook een fysiologisch relevant bereik van Young's modulus, namelijk 0,3 -. 300 kPa 16-22 De bestaande werkwijzen te vervaardigen PA gels voor celcultuur zijn arbeidsintensief en dus prepared in kleine batches. Enkele moeilijkheden bij de bereiding van PA gels celsubstraten voort uit het vereiste dat de gels worden bereid: 1) in afwezigheid van zuurstof om volledige polymerisatie mogelijk, 2) met een vlakke oppervlakte uniforme cel toe hechting en verspreiding, en 3) vast aan de onderkant van de celkweekschaal te voorkomen drijven.
Verschillende groepen hebben geprobeerd om PA gels voor celcultuur te produceren in grote batches. Semler et al. Bereide dikke vellen PA gels waarvan vervolgens "cut" met een perforator en geplaatst in 96-well platen. 23 Deze methode is beperkt tot stijver gels, namelijk> 1 kPa in Young's modulus, want zachter gels zijn "sticky", moeilijk te snijden en gemakkelijk beschadigd. Mih et al. Ontwikkelden een meer geavanceerde techniek waardoor de gels rechtstreeks worden gepolymeriseerd glazen bodem multi- putjesplaat. <sup> 6 Dit werd bereikt door het gieten van de gel-oplossingen in gefunctionaliseerde glas-bodemplaten en de vorming van gels door "sandwichen" ze met een aangepaste dekglaasje array. 6 Hoewel veelbelovend, lichte voorsprong effecten werden nog waargenomen met deze techniek. Daarnaast is de techniek vereist een speciaal ontworpen matrix niet onmiddellijk door veel laboratoria en kostbare glazen bodem putjes.
Dit artikel beschrijft een eenvoudige en goedkope manier om PA gels monteren in een plaat met meerdere putjes die door elk laboratorium gemakkelijk kunnen worden vastgesteld. Hier wordt een flexibele kunststof gebruikte drager, die twee kanten heeft – een hydrofoob is, dat afweermiddel voor PA gels, en een hydrofiele, die covalent bindt PA gel op afzetting. Zodra PA gel platen worden gedeponeerd en permanent aangebracht op de flexibele kunststof steun, maakt het hanteren van gels van elke dikte of stijfheid en snij ze in elke gewenste vorm. Dit ca.oach produceert niet alleen de aangepaste plastic 'coverslips' in de maten anders niet in de handel verkrijgbaar, maar voorkomt ook de noodzaak om glasoppervlakken-treat pre, ofwel dekglaasjes of de putten van dure glazen bodem putjes, met een PA binding oplossing, dat is een vervelende en tijdrovende stap. Tenslotte kan uniform PA gels platen worden bereid in grote series en opgeslagen de gehydrateerde enkele maanden.
Kortom, de assay hier gepresenteerde is een verbetering over bestaande werkwijzen in verschillende aspecten. Ten eerste, het proces van multi-putjesplaat samenstel efficiënt, en de totale kosten van de benodigde materialen is laag. Ten tweede worden de hydrogelen in grote batches in een homogene gel film. Tenslotte uitsluitend materialen die commercieel verkrijgbaar zijn vereist. De bruikbaarheid van de test wordt geïllustreerd door onderzoeken van het effect van substraat stijfheid op celmorfologie en verspreidingsgebied.
Polyacrylamide gels, oorspronkelijk ontwikkeld voor elektroforese, 28 worden nu routinematig gebruikt als celkweek substraten om de effecten van substraat stijfheid op celmorfologie, beweeglijkheid en communicatie 3,24,29 onder celeigenschappen bestuderen. Polyacrylamide staat manipulatie substraat stijfheid om de stijfheid van alle zachte weefsels in het lichaam omvatten (0,3-300 kPa) 1 met een eenvoudige verandering in polymeervoorloper concentratie (Figuur 2, Tabel 1,…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Reagents | |||
40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
Disposable lab equipment | |||
flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
UV oven | UVITRON | UV1080 | |
Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |