Multiwell הנוקשות Assay לחקר תגובות תא הנוקשת תלויות מבוסס polyacrylamide פשוטה
Summary
Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Abstract
Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 – 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn’t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.
Introduction
רוב הרקמות בגוף הן חומרי viscoelastic רכים עם מודול יאנג הנע בין 0.1 kPa למוח עד 100 kPa לסחוס רך, עדיין, רובם במחקר בתאים במבחנה מתבצע על קלקר תרבית רקמה (TCP) שבו יש מודול של ~ 1-GPA . 1 התאמה נוקשות זו מאוד משפיעה על הדרך בה תאים מגיבים לסביבתם. גוף הולך וגדל של מחקר הוא בכך מסור להבהרת ההשפעה של מצע נוקשות על גורלם של סוגי תאים שונים, 2,3 כולל תאי גזע. 4 כתוצאה מכך, הידרוג מרובה פותחו כדי לסייע בהבנה של תא נוקשות תלויה הביולוגיה כולל polyacrylamide (PA), פוליאתילן גליקול 5-7 (PEG), 8,9 polydimethylsiloxane (PDMS), 10 ואלגינט. 11 בעוד ההוכחה לכך שיש מצע נוקשות השפעה מהותית על גורל תא גדלה, רוב המחקרים שנערכו ב בקנה מידה קטנה עם מספר קטן של samples. מחקרים שיטתיים, רב-ממדיים על ההשפעה של מצע נוקשות למערך של סוגי תאים או תנאים סביבתיים הם נדירים. 12
מספר טכנולוגיות הידרוג'ל תפוקה גבוהה מבטיחות פותחו, כולל microarrays מבוסס PEG, 13 מכשירים microfluidic לייצור microbeads agarose הידרוג'ל, 14 או מיקרו וננו-מוטות שבו קשיחות היא מווסת על ידי הקוטר והגובה של microrods. 15 עם זאת , הטכנולוגיות להכנת מצעים כאלה הם מתוחכמים וזמינים למספר מוגבל של מעבדות. מחקרים רבים מעורבים תגובות תא נוקשות מווסתת מנצל polyacrylamide ג'לי (PA) שהם לא רק זולים ופשוטים ליישום, אלא גם להציג מגוון רלוונטי מבחינה פיזיולוגית של מודול יאנג, כלומר 0.3 -. 300 kPa 16-22 עם זאת, קיימים שיטות לפברק הרשות הפלסטינית ג 'לים תרבית תאים הם עבודה אינטנסיבית וכתוצאה מכך הכנהared בקבוצות קטנות. חלק מהקשיים הכרוכים בהכנה של ג'לי הרשות הפלסטינית כמו מצעי תאי גזע מהדרישה שג'לים צריך להיות מוכן: 1) בהעדר החמצן כדי לאפשר פילמור מלא, 2) עם משטח שטוח וחלק להתיר תא אחיד התקשרות והפצה, ו 3) באופן קבוע המודבק בתחתית של צלחת תרבית תאים כדי למנוע צף.
כמה קבוצות ניסו לייצר ג'לי רשות לתרבית תאים בקבוצות גדולות. Semler et al. גיליונות עבים מוכנים של ג'לי הרשות הפלסטינית שהיו אז "לחתוך" עם ניקוב חורים והניחו לתוך 96-גם צלחות. 23 עם זאת, שיטה זו מוגבלת לג'לים נוקשה, כלומר,> 1 kPa במודול יאנג, כי רך יותר ג 'הם "דביק", קשה לחתוך, ונפגע בקלות. MIH et al. פיתח טכניקה מתוחכמת יותר המאפשרת לג'לים להיות polymerized ישירות בצלחת multiwell זכוכית תחתונה. <sעד> 6 זו הושגה על ידי שפיכת פתרונות ג'ל לצלחות זכוכית תחתונה פונקציונליות ויצירת ג'לים על ידי "הרבדה" אותם עם מערך coverglass המותאם אישית. 6 למרות שהשפעות קצה מבטיחות מאוד, קלות עדיין נצפו עם טכניקה זו. בנוסף, הטכניקה דורשת מערך אישית מעוצב לא נגיש באופן מיידי למעבדות רבות, כמו גם צלחות multiwell זכוכית תחתונה יקרות.
מאמר זה מתאר דרך פשוטה וזולה כדי להרכיב ג'לי הרשות הפלסטינית בצלחת multiwell שאפשר לאמץ בקלות על ידי כל מעבדה. כאן, תמיכת פלסטיק גמישה מנוצלת, שבו יש שני צדדים – אחד הידרופובי, שהוא דוחה לג'לי הרשות הפלסטינית, ואחד הידרופילי, שנקשר קוולנטית ג'ל הרשות הפלסטינית על תצהיר. ברגע גיליונות ג'ל הרשות הפלסטינית מופקדים וקבוע מודבקים תמיכת פלסטיק הגמישה, זה מאפשר טיפול בג'לים של כל עובי או נוקשות וחיתוכם לכל צורה רצויה. appr זהאוח לא רק מייצר מותאם אישית 'coverslips' הפלסטיק בגדלים לא אחר זמין מסחרי, אבל גם מונע את הצורך לטיפול מקדים משטחי זכוכית, או coverslips זכוכית או בארות של צלחות multiwell זכוכית תחתונה יקרות, עם פתרון הרשות הפלסטינית מחייב, שהוא מייגע וצעד זמן רב. לבסוף, ניתן להכין גיליונות ג'לי הרשות הפלסטינית אחידים בקבוצות גדולות ומאוחסנים דה-hydrated במשך כמה חודשים.
לסיכום, assay שהוצג כאן הוא שיפור פני שיטות קיימות במספר היבטים. ראשית, התהליך של הרכבה צלחת multiwell הוא יעיל, ואת העלות הכוללת של חומרים הדרושים היא נמוכה. שנית, הידרוג מיוצר בקבוצות גדולות בסרט ג'ל הומוגנית אחת. לבסוף, רק חומרים שהם זמינים מסחריים נדרשים. השירות של assay מודגם על ידי לחקור את ההשפעה של מצע נוקשות על מורפולוגיה של תאים ומתפשטים באזור.
Protocol
Representative Results
Discussion
ג'ל polyacrylamide, שפותח במקור עבור אלקטרופורזה, 28 המשמשים כיום באופן שיגרתי כמו מצעי תרבית תאים כדי לחקור את ההשפעות של מצע נוקשות על מורפולוגיה של תאים, תנועתיות, ותקשורת 3,24,29 בין מאפייני תא אחרים. Polyacrylamide מאפשרת מניפולציה של מצע נוקשות להקיף את הנוקשות של כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by start-up funds provided to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University as well as by a President’s Research Fund (PRF) grant awarded to Dr. Silviya Zustiak by Saint Louis University. We thank Naveed Ahmed and Keval Shah for technical assistance.
Materials
| Reagents | |||
| 40% Acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| 2% Bis-acrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-Rad | 161-07000 | |
| TEMED | Sigma Aldrich | T9281 | |
| Sulfo-SANPAH | Thermo Scientific | 22589 | |
| Collagen Type 1, from Rat tail, 3.68 mg/mL | BD Biosciences | 354236 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher Scientific | BP231-100 | |
| Hydrophobic solution – Repel Silane | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-1332-01 | |
| PBS (1x), pH 7.4 | HyClone | SH30256.01 | |
| Polydimehylsiloxane (PDMS) [Slygard 182 Elastomer Kit] | Elsworth Adhesives | 3097358-1004 | |
| Tyrpsin/EDTA (10x) | Sigma Aldrich | 44174 | |
| RPMI-1640 Medium (1x) | HyClone | SH30027-02 | |
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30073-03 | |
| Penicillin Streptomycin | MP Biomedicals | 1670046 | |
| Detergent – Triton-X | Sigma Aldrich | T8787 | |
| Formaldehyde 37% Solution | Sigma Aldrich | F1635 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A2153 | |
| BSA-based cell adhesion blocking kit – ECM Cell Adhesion Array Kit | Chemicon International | ECM540 | |
| Disposable lab equipment | |||
| flexible plastic support – GelBond PAG Film for Polyacrylamide Gels | GE Healthcare Bio-Sciences | 309819 | |
| Glass Plates | Slumpys | GBS4100SFSL | |
| 50 mL Conicals | Fisher Scinetific | 3181345107 | |
| 15 mL Conicals | FALCON | 352097 | |
| Micro centrifuge tubes | Fisher Scinetific | 2 mL: 02681258 | |
| 96-well plate (flat bottom) | Fisher Scinetific | 12565501 | |
| Disposable Pipettes (1 mL, 2mL, 5mL, 10mL, 25 mL, 50mL) | Fisher Scinetific | 1 mL: 13-678-11B, 2mL: 05214038, 5mL(FALCON): 357529, 10mL: 13-678-11E, 25mL: 13-678-11, 50mL: 13-678-11F | |
| Glass Transfer Pipettes | Fisher Scinetific | 5 3/4": 1367820A, 9":136786B | |
| Pipette Tips (1-200uL, 101-1000uL) | Fisher Scinetific | 2707509 | |
| Plastic Standard Disposable Transfer Pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9D | |
| Parafilm | PARAFILM | PM992 | |
| Powder Free Examination Gloves | Quest | 92897 | |
| Silicone spacers – Silicone sheet, 0.5 mm thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio-Labs | JTR-S-0.5 | |
| Large/non-disposable lab equipment | |||
| Light and Flourescent Microscope (Axiovert 200M) | Zeiss | 3820005619 | |
| Microscope Software | Zeiss | AxioVision Rel. 4.8.2 | |
| UV oven | UVITRON | UV1080 | |
| Vacuum chamber/degasser | BelArt | 999320237 | |
| Vacuum pump for degasser | KNF Lab | 5097482 | |
| Tissue Culture Hood | NUAIRE | NU-425-600 | |
| Chemical Fume Hood | KEWAUNEE | 99151 | |
| Inverted Microscope (Axiovert 25) | Zeiss | 663526 | |
| Incubator | NUAIRE | NU-8500 | |
| Pipette Aid | Drummond Scientific Co. | P-76864 | |
| Hemacytometer | Bright-Line | 383684 |
References
- Levental, I., Georges, P. C., Janmey, P. A. Soft biological materials and their impact on cell function. Soft Matter. 3, 299-306 (2007).
- Minton, K. Mechanotransduction: A stiff response. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (8), 500-500 (2014).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Watt, F. M., Huck, W. T. Role of the extracellular matrix in regulating stem cell fate. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (8), 467-473 (2013).
- Zustiak, S., Nossal, R., Sackett, D. L. Multiwell stiffness assay for the study of cell responsiveness to cytotoxic drugs. Biotechnology and bioengineering. 111 (2), (2014).
- Mih, J. D., et al. A multiwell platform for studying stiffness-dependent cell biology. PLoS One. 6 (5), e19929 (2011).
- Sunyer, R., Jin, A. J., Nossal, R., Sackett, D. L. Fabrication of hydrogels with steep stiffness gradients for studying cell mechanical response. PloS one. 7 (10), e46107 (2012).
- Herrick, W. G., et al. PEG-phosphorylcholine hydrogels as tunable and versatile platforms for mechanobiology. Biomacromolecules. 14 (7), 2294-2304 (2013).
- Tokuda, E. Y., Leight, J. L., Anseth, K. S. Modulation of matrix elasticity with PEG hydrogels to study melanoma drug responsiveness. Biomaterials. 35 (14), 4310-4318 (2014).
- Feng, J., et al. Substrate stiffness influences the outcome of antitumor drug screening in vitro. Clinical hemorheology and microcirculation. 55 (1), 121-131 (2013).
- Ramamoorthi, K., Hara, J., Ito, C., Asuri, P. Role of Three-Dimensional Matrix Stiffness in Regulating the Response of Human Neural Cells to Toxins. Cellular and Molecular Bioengineering. 7 (2), 1-7 (2014).
- Tilghman, R. W., et al. Matrix rigidity regulates cancer cell growth and cellular phenotype. PloS one. 5 (9), e12905 (2010).
- Gobaa, S., et al. Artificial niche microarrays for probing single stem cell fate in high throughput. Nature methods. 8 (11), 949-955 (2011).
- Kumachev, A., et al. High-throughput generation of hydrogel microbeads with varying elasticity for cell encapsulation. Biomaterials. 32 (6), 1477-1483 (2011).
- Fu, J., et al. Mechanical regulation of cell function with geometrically modulated elastomeric substrates. Nature Methods. 7 (9), 733-736 (2010).
- Pelham, R. J., Wang, Y. Cell locomotion and focal adhesions are regulated by substrate flexibility. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (25), 13661-13665 (1997).
- Tse, J. R., Engler, A. J., et al. Preparation of hydrogel substrates with tunable mechanical properties. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino … [et al.]. 10 (Unit 10 16), (2010).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell motility and the cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Lo, C. -. M., Wang, H. -. B., Dembo, M., Wang, Y. -. l. Cell movement is guided by the rigidity of the substrate. Biophysical journal. 79 (1), 144-152 (2000).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell. 126 (4), 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -. l. Tissue cells feel and respond to the stiffness of their substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
- Young, D. A., Choi, Y. S., Engler, A. J., Christman, K. L. Stimulation of adipogenesis of adult adipose-derived stem cells using substrates that mimic the stiffness of adipose tissue. Biomaterials. 34 (34), 8581-8588 (2013).
- Semler, E. J., Lancin, P. A., Dasgupta, A., Moghe, P. V. Engineering hepatocellular morphogenesis and function via ligand-presenting hydrogels with graded mechanical compliance. Biotechnology Bioengineering. 89 (3), 296-307 (2005).
- Reinhart-King, C. A., Dembo, M., Hammer, D. A. Cell-cell mechanical communication through compliant substrates. Biophysical journal. 95 (12), 6044-6051 (2008).
- Fischer, R. S., Myers, K. A., Gardel, M. L., Waterman, C. M. Stiffness-controlled three-dimensional extracellular matrices for high-resolution imaging of cell behavior. Nature protocols. 7 (11), 2056-2066 (2012).
- Quinlan, A. M., Billiar, K. L. Investigating the role of substrate stiffness in the persistence of valvular interstitial cell activation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 100 (9), 2474-2482 (2012).
- Zustiak, S. P., Leach, J. B. Hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogel scaffolds with tunable degradation and mechanical properties. Biomacromolecules. 11 (5), 1348-1357 (2010).
- Chrambach, A., Rodbard, D. Polyacrylamide gel electrophoresis. Science. 172 (3982), 440-451 (1971).
- Lin, Y. C., et al. Mechanosensing of substrate thickness. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 82 (4), 041918 (2010).
- Chrambach, A. . The Practice of Quantitative Gel Electrophoresis. , (1985).
- Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. Cell adhesion force microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (2), 471-476 (1999).
- Javaherian, S., Li, K. J., McGuigan, A. P. A simple and rapid method for generating patterned co-cultures with stable interfaces. BioTechniques. 55 (1), 21-26 (2013).
- Tarone, G., Galetto, G., Prat, M., Comoglio, P. M. Cell surface molecules and fibronectin-mediated cell adhesion: effect of proteolytic digestion of membrane proteins. The Journal of cell biology. 94 (1), 179-186 (1982).
- Trujillo, V., Kim, J., Hayward, R. C. Creasing instability of surface-attached hydrogels. Soft Matter. 4 (3), 564-569 (2008).
- Saha, K., et al. Surface creasing instability of soft polyacrylamide cell culture substrates. Biophysical journal. 99 (12), L94-L96 (2010).
- Buxboim, A., Rajagopal, K., Andre’EX, B., Discher, D. E. How deeply cells feel: methods for thin gels. Journal of Physics: Condensed Matter. 22 (19), 194116 (2010).
- Merkel, R., Kirchgessner, N., Cesa, C. M., Hoffmann, B. Cell force microscopy on elastic layers of finite thickness. Biophysical journal. 93 (9), 3314-3323 (2007).
