Abstract
दिल के विकास के दौरान, दौरे-विशिष्ट संरचनात्मक और कार्यात्मक sarcomeres, सिकुड़ा myofibrils, intercalated डिस्क सहित इकाइयों, और costameres की पीढ़ी समय और अंतरिक्ष में कई घटकों के समन्वित विधानसभा की आवश्यकता है। इन घटकों के विधानसभा में व्यवधान विकासात्मक दिल दोषों की ओर जाता है। Immunofluorescent धुंधला तकनीक myofibril परिपक्वता की जांच के लिए सुसंस्कृत cardiomyocytes में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन इस पूर्व vivo दृष्टिकोण myocytes पूरी तरह से endocardial cues के संस्कृति, सामान्य में विवो मैकेनिकल आदानों की कमी है, और अनुपस्थिति में अलग होगा करने के लिए किस हद तक सीमित है। माउस दिल के विकास का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक के इस्तेमाल के लिए वांछनीय है, लेकिन अधिक तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है, और विधियों अक्सर दिल के विकास के प्रारंभिक दौर में sarcomeres कल्पना करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता और संकल्प की कमी है। यहाँ, हम म्यू-immunostain सह करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णनएकाधिक प्रोटीन या करने के लिए भ्रूण माउस दिल में Immunofluorescent धुंधला के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन सह-कल्पना और विकासशील myofibrils, intercalated डिस्क, और costameres का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का उपयोग करें। इस विधि के आगे विकास के हृदय दोष है कि नेतृत्व परिवर्तन की वजह से cardiomyocyte संरचनात्मक परिवर्तनों का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
Cardiomyocytes midline की ओर पलायन और रैखिक दिल ट्यूब 1,2 फार्म के बाद विकास के दौरान, दिल संकुचन जल्द ही शुरू करते हैं। sarcomere cardiomyocyte भीतर बुनियादी सिकुड़ा इकाई है; इस बेहद संगठित cytoskeletal संरचना sarcomeric α-actinin (S-α-actinin) और एम लाइन के लिए लंगर मायोसिन फाइबर (चित्रा 1) द्वारा जेड-डिस्क के लिए लंगर एक्टिन तंतु होते हैं। Cardiomyocyte परिपक्व होती है, sarcomeres सेल भर में विस्तार है कि myofibrils फार्म करने के लिए श्रृंखला में इकट्ठा। Myofibrils intercalated डिस्क से cardiomyocyte के छोर तक संचालन कर रहे हैं, इस तरह के एस-α-actinin 3, adherens के रूप में जेड-डिस्क तत्वों का एक सबसेट के साथ एक संक्रमणकालीन जंक्शन जिसमें सेल सेल junctional संरचना ऐसी एन cadherin के रूप में जंक्शन प्रोटीन और β catenin, अंतर जंक्शन प्रोटीन, और desmosomes (चित्रा 1) 4। अनुदैर्ध्य झिल्ली, भी परिधीय myofibrils के Z-डिस्क के साथcostameres के माध्यम से कोशिका झिल्ली को देते हैं; इन विशेष फोकल adhesions (चित्रा 1) 4 myofibril, प्लाज्मा झिल्ली, और cardiomyocyte करने के लिए अतिरिक्त संरचनात्मक समर्थन प्रदान करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स के बीच एक लंगर प्रदान करते हैं। प्रारंभिक दिल के विकास में, cardiomyocytes निलय अंतरिक्ष में फैलाना और अपेक्षाकृत परिपक्व myofibrils 5 होते हैं कि trabeculae रूप में जाना जाता उंगली की तरह अनुमानों में व्यवस्थित कर रहे हैं। दिल के विकास के रूप में आय, उप एपिकार्डियल क्षेत्र में cardiomyocytes निलय दीवारों शामिल हैं, लेकिन sarcomere और myofibril विधानसभा घरनदार मायोकार्डियम 5,6 के साथ तुलना में देरी कर रहे हैं कि कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम फार्म करने के लिए पैदा करना।
Sarcomere और myofibril विधानसभा के मॉडल सुसंस्कृत सीधा कर रहे हैं लेकिन एक तीन आयामी वातावरण, रक्त प्रवाह की कमी है जो cardiomyocytes 7-10, और अन्य हृदय सेल के साथ संपर्क पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन से काफी हद तक आविवो में मौजूद है। माउस भ्रूण दिल में immunofluorescence का उपयोग उच्च संकल्प संरचनात्मक पढ़ाई तकनीकी रूप से चुनौती दे रहे हैं, और कुछ अध्ययनों माउस हृदय विकास के दौरान intercalated डिस्क और costameres के उद्भव का पता लगाया है। catenin β adherens जंक्शन प्रोटीन भ्रूण दिन से intercalated डिस्क (ई) 17.5 11, एन cadherin प्रसव के बाद दिन 0 13 बनाम E18.5 12 से intercalated डिस्क का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि रैखिक संरचनाओं के लिए localizes, और costameres में पाया गया है करने के लिए स्थानीय बनाना प्रतीत होता है E18.5 14 है, लेकिन इन प्रोटीनों पहले विकासात्मक समय अंक 11-13 में फैलाना और अधिक निरंतर झिल्ली वितरण प्रदर्शित करते हैं।
यहाँ, हम intercala के उद्भव सहित myofibril और cardiomyocyte विकास के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कि immunostaining और sectioned माउस भ्रूण दिलों की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एक सीधा और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णनटेड के रूप में जल्दी E12.5 और E16.5 पर नवजात costameres के रूप में डिस्क। इस प्रोटोकॉल sarcomere गठन के साथ ही myofibril और cardiomyocyte परिपक्वता पर परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है।
Protocol
नोट: सभी प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं UCSF संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।
1. cryopreservation और भ्रूण माउस दिल का निर्धारण।
1.1) भ्रूण दिल स्नैप ठंड
- इष्टतम काटने तापमान के साथ एक 3.5 सेमी पेट्री डिश और 7 मिमी cryomolds भरें (अक्टूबर) मध्यम (सामग्री तालिका देखें)। एक रासायनिक हुड में, तरल नाइट्रोजन में दो-methylbutane शांत करते हैं।
- 10 सेमी पेट्री डिश, 3.5 सेमी पेट्री डिश में पीबीएस के 10 एमएल में फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 30 मिलीलीटर बांटना, और बर्फ पर सभी पेट्री डिश जगह है। एक 10 सेमी पकवान और गर्भवती माउस प्रति कई 3.5 सेमी व्यंजन तैयार करते हैं।
- पहले से ठंडा पीबीएस में विच्छेदन प्रदर्शन, 15 के रूप में वर्णित भ्रूण अलग।
- संक्षेप में, सीओ 2 narcosis और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था का उपयोग कर गर्भवती महिला euthanize।
- पेट में एक चीरा बनाने ALO वाहिकाओं काटने से गर्भाशय बाहर काटनागर्भाशय की भीतरी वक्रता एनजी, और ठंडा पीबीएस युक्त एक 10 सेमी पेट्री डिश के लिए गर्भाशय हस्तांतरण।
- बर्फ ठंड पीबीएस युक्त एक व्यक्ति 3.5 सेमी पेट्री डिश के लिए प्रत्येक भ्रूण और हस्तांतरण के बीच गर्भाशय में काटें। 15 में वर्णित के रूप में प्रत्येक भ्रूण अलग।
- है, ठीक संदंश का उपयोग पेरिकार्डियल गुहा खोलें महाधमनी, अवर रग Cava, और फेफड़े के नसों में कटौती करके दूर फेफड़ों और vasculature से दिल को हटाने, और अक्टूबर युक्त 3.5 सेमी पेट्री डिश में हस्तांतरण।
- दिल तो अक्टूबर युक्त 7 मिमी मोल्ड में दिल हस्तांतरण, कई सेकंड के लिए अक्टूबर में संतुलित करना। मोल्ड के नीचे करने के लिए दिल के पूर्वकाल दीवार पूरबी।
- धीरे तरल नाइट्रोजन कूल्ड दो-methylbutane में ढालना जगह है। ध्यान रखना 2-methylbutane तरल अक्टूबर या दिल को छूने की अनुमति देने के लिए नहीं। अक्टूबर सफेद ठोस है, जब तक तो सूखी बर्फ युक्त एक बर्फ बाल्टी को ढालना हस्तांतरण रुक। अगले भ्रूण पर जाएं।
- WRएपी Cryosectioning के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी और दुकान में cryomolds।
1.2) वैकल्पिक: paraformaldehyde (पीएफए) फिक्सिंग, cryoprotecting, और अक्टूबर भ्रूण दिल embedding
- 1X पीबीएस में 4% पीएफए के साथ एक 12 अच्छी तरह से टिशू कल्चर प्लेट के कुओं भरें।
- 1.1.3 में वर्णित के रूप में भ्रूण दिल बाहर काटना। एक अच्छी तरह से युक्त 4% पीएफए में हर दिल प्लेस और 4 डिग्री सीओ / एन पर तय कर लो।
- Cryoprotection: एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग, पीबीएस में 1.5 मिलीलीटर 15 के% सूक्रोज युक्त एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब हर दिल कदम है और दिल ट्यूब की तह तक डूब धीरे जब तक (4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन करने के लिए कई घंटे आंदोलन )। पीबीएस में 30% sucrose के एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब युक्त 1.5ml करने के लिए प्रत्येक दिल स्थानांतरण और दिल (ओ / एन करने के लिए कई घंटे) ट्यूब के नीचे डूब धीरे जब तक फिर से 4 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन।
- एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, अक्टूबर में cryoprotected दिल जगह है और इसे संतुलित करनाकई मिनट के अतिरिक्त सूक्रोज को दूर करने के लिए, तो अक्टूबर युक्त 7 मिमी मोल्ड में दिल हस्तांतरण। मोल्ड के नीचे करने के लिए दिल के पूर्वकाल दीवार पूरबी।
- तरल नाइट्रोजन कूल्ड दो-methylbutane या सूखी बर्फ या तो में ढालना रखकर अक्टूबर में दिल रुक।
- Cryosectioning के लिए तैयार है जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर पन्नी और दुकान में cryomolds लपेटें।
2. Cryosectioning
- -17 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट cryostat तापमान।
- प्लेस cryostat के चेंबर में cryomolds और 15-20 मिनट के लिए तापमान को संतुलित।
- Cryomold पलटना और मोल्ड से दिल ब्लॉक को निष्कासित करने के लिए कोमल दबाव का उपयोग करें। ढाला ऊतक ब्लॉक के शीर्ष करने के लिए दिल के पूर्वकाल दीवार पूरबी।
- चक पर अक्टूबर की एक बड़ी गिरावट, जगह और चक पर फ्रीज करने के लिए अक्टूबर ड्रॉप पर दिल ब्लॉक माउंट। दिल के पूर्वकाल दीवार चक से दूर है कि इस तरह के उन्मुखीकरण रखें।
- चक लोड और वह घुड़सवारcryostat वस्तु धारक पर कला ब्लॉक। ब्लेड के कोण नमूने के लिए 3-5 डिग्री रिश्तेदार है कि इतना समायोजित करें।
- एक सकारात्मक आरोप लगाया कोटिंग के साथ पूर्व इलाज किया गया है कि खुर्दबीन स्लाइड पर 10 माइक्रोन वर्गों लीजिए (सामग्री तालिका देखें)। -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारण से पहले पूरी तरह से सूखे की अनुमति दें।
3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस
- तस्वीर जमी वर्गों के लिए, ठीक है और आरटी पर एक धूआं हुड में 10 मिनट के लिए एसीटोन में ऊतक permeabilize।
- तस्वीर जमी और पीएफए तय वर्गों के लिए, अक्टूबर को दूर करने के लिए 20 मिनट के लिए पीबीएस 0.1% ट्राइटन X-100 में सेते हैं और पीएफए तय वर्गों permeabilize करने के लिए।
- पीबीएस में पतला 1x अवरुद्ध बफर में 45 मिनट के लिए ब्लॉक।
- आरटी पर 45 मिनट के लिए पीबीएस 0.1% बीच 20 में 100 (चर्चा देखें): माउस में उत्पन्न एक प्राथमिक एंटीबॉडी का उपयोग करते हैं, तो गधा या बकरी विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) एक पतला monovalent फैब टुकड़ा में सेते हैं।
- आर टी या कम 2 घंटे के लिए 1x अवरुद्ध बफर में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी या एंटीबॉडी में सेतेहे / 4 डिग्री सेल्सियस पर एन (विशिष्ट dilutions के लिए सामग्री / उपकरण की तालिका देखें)।
- आरटी पर 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में तीन बार वर्गों धो लें।
- एक पतला एलेक्सा Fluor संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी में सेते हैं: 500 प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 2 घंटे के लिए बफर अवरुद्ध में।
- प्रकाश से सुरक्षित आरटी पर 10 मिनट के लिए 1x पीबीएस में तीन बार वर्गों धो लें।
- वैकल्पिक: तो, नाभिक लेबल पीबीएस के साथ कुल्ला करने के लिए (प्रकाश से सुरक्षित) आरटी पर पीबीएस में 2000: Hoechst डाई में सेते एक पतला।
- पोस्ट तय आरटी पर 1 मिनट के लिए 1% पीएफए में वर्गों लेबल।
- एक coverslip के साथ कवर तो स्लाइड के प्रत्येक के अंत पर मध्यम से दो बूँदें रखने और से (नाभिक पहले से ही लेबल नहीं हैं अगर DAPI के साथ) माउंट विरोधी फीका माध्यम में स्लाइड। सील नेल पॉलिश के साथ coverslips। स्टोर छवि के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से रक्षा की।
4. confocal इमेजिंग और छवि विश्लेषण
- उपयुक्त लेजर तरंग दैर्ध्य, कैमरा, और confocal खुर्दबीन इंक को चालू करेंमंच प्रस्तावक और जेड मोटर luding। इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रोग्राम लॉन्च। क्रमश: Hoechst-, एलेक्सा 488-, और एलेक्सा 568 से सना हुआ वर्गों इमेजिंग के लिए 405, 488, और 561 लेजर तरंग दैर्ध्य का प्रयोग करें।
नोट: हमारी हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के विनिर्देशों के लिए सामग्री तालिका देखें। - स्लाइड मंच पर नियंत्रण स्लाइड (एक औंधा माइक्रोस्कोप के लिए नीचे coverslip) माउंट।
- 4X उद्देश्य का उपयोग, (सामग्री तालिका देखें) नमूना और हित के क्षेत्र हैं। उच्च बढ़ाई इमेजिंग जब एक नक्शे के रूप में उपयोग करने के लिए छवि पर कब्जा।
- स्लाइड चरण के लिए कम से कम समायोजन करने, स्लाइड निकालें। 60x तेल विसर्जन उद्देश्य को बदलें, (सामग्री तालिका देखें) उद्देश्य पर तेल की एक छोटी सी बूंद जगह है, और स्लाइड मंच पर (नीचे coverslip) स्लाइड जगह।
- फिर नमूना का पता लगाएं। प्रत्येक चैनल के लिए वांछित स्तर तक लेजर शक्ति, जोखिम समय है, और binning सेट करें।
नोट: हम आम तौर पर लेजर 0.8 की शक्ति, 100 मिसे के कैमरे जोखिम समय है, और 2 की binning उपयोग (एसईई सामग्री तालिका) हार्डवेयर और सॉफ्टवेयर के विनिर्देशों के लिए; इष्टतम सेटिंग्स empirically का एक प्रयोग के लिए निर्धारित करने की आवश्यकता है।- इष्टतम सेटिंग्स निर्धारित कर रहे हैं एक बार, प्रयोग के भीतर सभी ऊतक वर्गों के लिए एक ही सेटिंग का उपयोग करें। (इस जानकारी के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा) प्रत्येक चैनल के लिए इष्टतम तीव्रता रेंज नोट करने के लिए तीव्रता हिस्टोग्राम का प्रयोग करें।
- फिर Z ढेर के ऊपरी और निचले सीमा चुनते हैं, उचित लेजर चैनलों का चयन: अधिग्रहण समारोह का उपयोग AZ स्टैक उत्पन्न करता है। सॉफ्टवेयर द्वारा प्रदान की ऑप्टिकल टुकड़ा मोटाई का आधा मूल्य है कि AZ स्टैक कदम आकार चुनें। छवियों को इकट्ठा करने के लिए "रन" पर क्लिक करें।
- फिजी 16 या छवि विश्लेषण के लिए एक तुलनीय कार्यक्रम का उपयोग करें। फिजी के भीतर, कस्टम रंग मोड विकल्प और अलग खिड़कियों में विभाजित चैनल के साथ Z स्टैक फ़ाइल खोलें। मेनू अधोगामी छवि से "चमक / विपरीत समायोजित" उपकरण को खोलें; प्रत्येक चैनल के भीतर, एसईटी इष्टतम हिस्टोग्राम तीव्रता रेंज 4.5.1 में निर्धारित की। सभी Z ढेर करने के लिए इन चैनल पर्वतमाला लागू करें विश्लेषण किया जा रहा है।
- छवि> रंग पुलडाउन मेनू का उपयोग करते हुए एक समग्र छवि में अलग-अलग चैनलों मिलाएं।
- छवि> Stacks-> Z परियोजना मेनू का उपयोग समग्र छवि से एक चपटे Z स्टैक बनाएँ। इस छवि को 3 डी छवि की तुलना में काफी उज्जवल हो जाएगा; नियंत्रण नमूना oversaturation बचने के लिए और प्रयोगात्मक चपटा Z ढेर करने के लिए एक ही सेटिंग्स लागू करने के लिए हिस्टोग्राम तीव्रता सीमा समायोजित।
- एक 3 डी छवि को उत्पन्न करने के लिए, पहली बार उपयोग छवि> Stacks-> 3 डी परियोजना मेनू 17। एक्स-अक्ष या रोटेशन के y अक्ष या तो चुनें। Z स्टैक कदम आकार के रूप में माइक्रोन की एक ही नंबर के रूप में टुकड़ा रिक्ति सेट करें। वांछित कुल रोटेशन चुनें और फिर प्लगइन्स लटकते मेनू से छवि जम्मू 3D व्यूअर खोलने 1. के लिए रोटेशन कोण वेतन वृद्धि की स्थापना की। मात्रा के रूप में समग्र 4.8 में उत्पन्न छवि, प्रदर्शन चुनें, और फिर सेट1 या 2 के लिए कारक नमूना।
Representative Results
एक तस्वीर जमी और एसीटोन तय दिल में विभिन्न प्रोटीन के सह-धुंधला के लिए 6 शो ठेठ परिणामों के माध्यम से दो आंकड़े। के खिलाफ एंटीबॉडी reproducibly लेबल वाली जेड-डिस्क और उच्च विशिष्टता और न्यूनतम पृष्ठभूमि (आंकड़े 2A, 3 ए, 4 ए, 5 ए, 6A, और 6C) के साथ intercalated डिस्क S-α-actinin, चित्रा 6 दर्शाता है कि विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) monovalent फैब टुकड़ा प्रभावी रूप से ब्लॉक अंतर्जात माउस आईजीजी विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी से बाध्यकारी। catenin β adherens जंक्शन प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी cardiomyocytes और गैर cardiomyocyte कोशिकाओं दोनों की झिल्ली के लिए बाध्य है, और से उम्मीद के रूप में एस-α-actinin साथ सह स्थानीयकरण, E16.5 (चित्रा -2 और डी) में प्रकल्पित intercalated डिस्क में हुई वयस्क दिल 18 में β catenin धुंधला पैटर्न। βभ्रूण के दिल में एक Integrin इम्यूनोफ्लोरेसेंस विशेष रूप से चुनौती दे रहा है और अक्सर फोकल adhesions 14 की पहचान करने में विफल रहता है, लेकिन इन अध्ययनों में β1 Integrin धुंधला संभवतः में गठन नवजात costameres दर्शाती S-α-actinin लेबल जेड-डिस्क, के रूप में एक ही अवधि के साथ संकेत का पता चला E16.5 (चित्रा 3 डी)।
E12.5 पर, एस-α-actinin और tropomyosin (sarcomere पतली रेशा प्रोटीन) इम्यूनोफ्लोरेसेंस S-α-actinin के लिए इन कोशिकाओं (आंकड़े 4A और 5A में परिपक्व myofibrils के साथ संगत घरनदार cardiomyocytes में नियमित अवधि के साथ एक धुंधला पैटर्न से पता चला; 4B चित्रा tropomyosin के लिए)। संभवतः intercalated डिस्क का प्रतिनिधित्व E12.5 दिलों पर घरनदार cardiomyocytes में एन cadherin धुंधला तीव्र S-α-actinin धुंधला के क्षेत्रों (सी - - डी और चित्रा 6A चित्रा 5 ब) के साथ colocalize हो जाती थी। मेंघरनदार myocytes के विपरीत, कॉम्पैक्ट क्षेत्र में है-α-actinin रैखिक की तुलना में अधिक कबरा था, और tropomyosin धुंधला फैलाना बजाय रैखिक था (चित्रा -4 ए और 4 बी)। इस प्रकार, sarcomere विधानसभा घरनदार मायोकार्डियम की तुलना में कॉम्पैक्ट में बाद में हो सकता है। इसके अलावा, कॉम्पैक्ट क्षेत्र में एस-α-actinin और tropomyosin का अंतर पैटर्न पतली फिलामेंट में शामिल करने tropomyosin myofibril विधानसभा में एक बाद की घटना हो सकती है, जबकि कि एस-α-actinin, puncta और जल्दी अपरिपक्व जेड-डिस्क में आयोजित करता है सुझाव देते हैं।
चित्रा 7, मूवी 1, और 2 मूवी एक पीएफए तय E12.5 भ्रूण दिल से ठेठ परिणाम प्रदर्शित करता है। इन उदाहरणों में, एक LifeAct-RFPruby ट्रांसजेनिक भ्रूण इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था; LifeAct-RFPruby transgene 19 filamentous actin के लेबल लेकिन पीएफए निर्धारण की आवश्यकता है। एस-α-actinin के साथ लेबल जेड-डिस्क अधिकांश क्षेत्रों में कल्पना करने के लिए आसान थे, लेकिन संकेत करने वाली शोर अनुपात decre था तस्वीर जमी को दिल वर्गों (चित्रा 7A) की तुलना में ased; यह संकेत epitopes प्रोटीन पार लिंक नकाबपोश द्वारा की जा सकती है, जिसमें पीएफए तय ऊतक में एस-α-actinin इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए विशिष्ट था। चित्रा 7B filamentous actin की सह-दृश्य से पता चलता है और myofibrils (तीर) के भीतर S-α-actinin immunolabeled घरनदार myocytes (तीर) के निकट endocardial कोशिकाओं के भीतर और filamentous actin के। तीन आयामी छवि पुनर्निर्माण अतिरिक्त विवरण से पता चला: व्यक्ति cardiomyocytes अधिक आसानी से एक cardiomyocyte भीतर myofibrils मोटे तौर पर एक दूसरे के समानांतर थे, discerned थे, लेकिन अलग-अलग cardiomyocytes एक दूसरे (चित्रा 7C और डी, मूवी 1, और 2 मूवी के लिए अलग-अलग कोणों पर उन्मुख थे )। endocardial कोशिकाओं और cardiomyocytes के बीच करीब सन्निकटन बेहतर रूप में अच्छी तरह से तीन आयामी दृष्टिकोण में सराहना की गई।
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एम लाइन एक्टिन तंतु ओवरलैप जो मायोसिन फाइबर, एंकर, जबकि चित्रा 1. cardiomyocyte sarcomeres, intercalated डिस्क, और costameres। जेड-डिस्क, एक्टिन तंतु एंकर। एम लाइन - - जेड-डिस्क इकाई sarcomere एक जेड-डिस्क शामिल हैं। श्रृंखला में एकाधिक sarcomeres एक myofibril पैदा करते हैं। myofibril के पार्श्व अंत intercalated डिस्क नामक एक विशेष सेल सेल junctional संरचना में cardiomyocyte की अनुप्रस्थ सीमा में सम्मिलित करता है। परिधीय myofibrils cardiomyocytes के बीच बाह्य मैट्रिक्स के साथ फोकल adhesions जो फार्म costameres, के माध्यम से अनुदैर्ध्य cardiomyocyte प्लाज्मा झिल्ली से कनेक्ट। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2. एस α -actinin और भ्रूण दिन 16.5 पर β catenin इम्यूनोफ्लोरेसेंस। दिल excised किया गया था, तस्वीर जमे हुए, cryosectioned, एसीटोन तय है, और एस-α-actinin के खिलाफ (ए) माउस मोनोक्लोनल क्लोन EA53 एंटीबॉडी का उपयोग immunostained, जो लेबल वाले cardiomyocyte जेड-डिस्क और intercalated डिस्क, और catenin β adherens जंक्शन प्रोटीन के खिलाफ (बी) खरगोश polycloncal एंटीबॉडी। (सी) विलय छवियों S-α-actinin और β catenin धुंधला दिखा। (डी) बढ़ाया पैनल सी से ब्याज का क्षेत्र ; तारक मार्क एस-α-actinin और β catenin के सह-स्थानीयकरण के साथ intercalated डिस्क प्रकल्पित। छवियाँ पैनलों एसी के ऊपरी बाएँ में एपिकार्डियल परत के साथ, परिधीय बाएं निलय दीवार या कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम से प्राप्त किया गया। ओ बाहर तीव्रता हिस्टोग्राम प्रदर्शन रेंज 460-1600 (एफ संभव 0-65,535) दोनों S-α-actinin / 488 एनएम और β catenin / 561 एनएम लेजर चैनलों के लिए। स्केल बार 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. एस α -actinin और भ्रूण दिन 16.5 पर एक Integrin इम्यूनोफ्लोरेसेंस β। दिल excised किया गया था, तस्वीर जमे हुए, cryosectioned, एसीटोन तय है, और एस-α-actinin के खिलाफ (ए) माउस मोनोक्लोनल क्लोन EA53 एंटीबॉडी का उपयोग immunostained और Integrin β1 फोकल आसंजन प्रोटीन के खिलाफ (बी) बकरी पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी। (सी) विलय छवियों cardiomyocyte में β1 Integrin के रूप में अच्छी तरह से गैर cardiomyocyte कोशिकाओं दिखा। नोट दोनों फैलाना औरcardiomyocytes में Integrin संकेत β1 कबरा (डी) जेड-डिस्क में एस-α-actinin-धुंधला आस-पास के समान अवधि के साथ पैनल सी नोट कबरा, आवधिक β1 Integrin धुंधला (तीर) से ब्याज का क्षेत्र बढ़ाया।; इन संरचनाओं costameres प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। छवियाँ बाएं निलय कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम से प्राप्त किया गया। Β1 Integrin / 561 एनएम लेजर चैनल के लिए एस-α-actinin / 488 एनएम लेजर चैनल और 460-600 के लिए (संभव 0-65,535 के बाहर) तीव्रता हिस्टोग्राम प्रदर्शन रेंज 460-1200। स्केल बार 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4. एस α -actinin और भ्रूण दिन 12.5 पर tropomyosin इम्यूनोफ्लोरेसेंस: myofibril संगठन में घरनदार और कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम। littermate भ्रूण से दिल excised थे, जमे हुए, cryosectioned, एसीटोन तय है, और myofibril पतली फिलामेंट के खिलाफ S-α-actinin और (बी) माउस मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ (ए) माउस मोनोक्लोनल क्लोन EA53 एंटीबॉडी का उपयोग immunostained तस्वीर प्रोटीन tropomyosin (विकास अध्ययन हाइब्रिडोमा बैंक CH1)। घरनदार (तीर) और कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम (तीर) संकेत कर रहे हैं। कॉम्पैक्ट परत (ए) में puncta के साथ ही रैखिक धुंधला सहित धुंधला पैटर्न की एक श्रृंखला की तुलना में घरनदार मायोकार्डियम में नियमित अवधि के साथ रैखिक S-α-actinin धुंधला, ध्यान दें। यह भी कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम में घरनदार मायोकार्डियम में नियमित रूप से दौरा लेकिन अधिक फैलाना धुंधला के साथ रैखिक tropomyosin धुंधला ध्यान दें। Tropomyosin चैनल के लिए एस-α-actinin चैनल और 460-1,000 के लिए (संभव 0-65,535 के बाहर) तीव्रता हिस्टोग्राम प्रदर्शन रेंज 460-1,400। स्केल बार 10 माइक्रोन।"Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52644/52644fig4large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. एस α -actinin और भ्रूण दिन 12.5 पर एन-cadherin इम्यूनोफ्लोरेसेंस:। घरनदार cardiomyocytes में myofibrils और intercalated डिस्क दिल excised किया गया था, तस्वीर जमे हुए, cryosectioned, (ए) माउस मोनोक्लोनल क्लोन EA53 का उपयोग कर एसीटोन तय है, और immunostained एस-α-actinin और फोकल आसंजन प्रोटीन एन cadherin के खिलाफ (बी) खरगोश पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी के खिलाफ एंटीबॉडी। 0.2 माइक्रोन ऑप्टिकल स्लाइस AZ ढेर के रूप में एकत्र किए गए थे, और z ढेर छवियों को उत्पन्न करने चपटा कर रहे थे। (सी) विलय चपटा ढेर घरनदार cardiomyocytes भीतर एन cadherin और एस-α-actinin धुंधला दोनों दिखाने w के रूप मेंपक्ष पैनल सी से ब्याज की Hoechst डाई के साथ लेबल नाभिक (डी) बढ़ाया क्षेत्र के रूप में। तारक S-α-actinin और एन cadherin के सह-स्थानीयकरण के साथ intercalated डिस्क निशान। एस-α-actinin / 488 एनएम और एन cadherin / 561 एनएम लेजर चैनलों के लिए दोनों हेक्स्ट / 405 एनएम लेजर चैनल के लिए (संभव 0-65,535 के बाहर) और 470-2,000 तीव्रता हिस्टोग्राम प्रदर्शन रेंज 470-1,200। स्केल बार 10 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6. विरोधी माउस आईजीजी (एच + एल) monovalent फैब टुकड़ा प्रभावी रूप से ब्लॉक अंतर्जात माउस विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी से बाध्यकारी आईजीजी। भ्रूण दिल excised गया था E12.5, तस्वीर एसीटोन तय, cryosectioned, और immunostained, जमे हुए।
चित्रा 7. एस α -actinin और घरनदार cardi में actin संगठनएस-α-actinin के खिलाफ माउस मोनोक्लोनल क्लोन EA53 एंटीबॉडी जेड-डिस्क और intercalated डिस्क लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, जबकि भ्रूण दिन 12.5 पर omyocytes। LifeAct-RFPruby ट्रांसजेनिक माउस लाइन, filamentous actin के 19 कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। भ्रूण पीएफए-तय किया गया। 0.2 माइक्रोन ऑप्टिकल स्लाइस AZ ढेर के रूप में एकत्र किए गए थे (ए) चपटा Z हो चुकी है कि एस-α-actinin धुंधला तस्वीर जमी और एसीटोन तय वर्गों (आंकड़े 2-5) की तुलना में पीएफए तय ऊतक में अधिक फैलाना था पता चलता है।। (बी ) चपटा Z स्टैक filamentous actin और दोनों S-α-actinin पता चलता है। Myofibrils (तीर) के भीतर जेड-डिस्क के बीच स्थानीयकृत filamentous actin के प्रतिदीप्ति। Filamentous actin के प्रतिदीप्ति भी घरनदार myocytes (तीर) लाइन कि endocardial कोशिकाओं में देखा गया था। (सी) के ढेर के ऊपर से देखा के रूप में घरनदार cardiomyocytes के तीन आयामी दृश्य। (डी) के तीन आयामी देखेंघरनदार cardiomyocytes, के रूप में ढेर के नीचे से देखा। तीव्रता हिस्टोग्राम प्रदर्शन रेंज 470-900 (संभव 0-65,535 के बाहर) 488 एनएम लेजर चैनल और ए और बी में 561 एनएम लेजर चैनल के लिए दोनों के लिए; सी और डी स्केल बार 10 माइक्रोन में दोनों चैनलों के लिए प्रदर्शन रेंज 460-800। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
मूवी 1। एस α -actinin और भ्रूण दिन 12.5 पर घरनदार cardiomyocytes में actin संगठन के 360 डिग्री बारी-बारी से 3 डी दृश्य। चित्रा 6 से छवि ढेर फिजी छवि विश्लेषण कार्यक्रम के भीतर छवि जम्मू 3D व्यूअर प्लगइन का उपयोग कर तीन आयामों में गाया था। तीव्रता हिस्टोग्राम प्रदर्शन रेंज 470-800 (संभव 0-65,535 के बाहर) 488 एनएम और 561 एनएम लेजर चैनलों दोनों के लिए। </ P>
मूवी दो। भ्रूण दिन 12.5 पर घरनदार cardiomyocytes में एस α -actinin और actin संगठन के चयनित 3 डी दृश्य। चित्रा 6 से छवि ढेर फिजी छवि विश्लेषण कार्यक्रम के भीतर छवि जम्मू 3D व्यूअर प्लगइन का उपयोग कर तीन आयामों में गाया था। एक्स, वाई, जेड और कुल्हाड़ियों के आसपास छोटे घुमाव अपेक्षाकृत cardiomyocytes लेकिन सबसे cardiomyocytes के बीच गरीब संरेखण के भीतर myofibrils गठबंधन दिखाया। लघु घुमाव भी cardiomyocytes के आसपास एस-α-actinin कमी endocardial कोशिकाओं के करीब सन्निकटन का प्रदर्शन किया। तीव्रता हिस्टोग्राम प्रदर्शन रेंज 470-800 488 एनएम और 561 एनएम लेजर चैनलों के लिए दोनों (संभव 0-65,535 के बाहर)।
Discussion
इष्टतम ऊतक निर्धारण तकनीक और कमजोर पड़ने के अनुभव से प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। हमारे हाथ में, स्नैप-ठंड S-α-actinin, β-catenin, β1-Integrin, tropomyosin, Talin () नहीं दिखाया और एन cadherin सहित कई cardiomyocyte एंटीजन, के लिए पीएफए निर्धारण करने के लिए बेहतर है; इसके विपरीत, पीएफए निर्धारण फोकल आसंजन काइनेज के लिए बेहतर परिणाम पैदावार () नहीं दिखाया। पीएफए द्वारा गठित प्रोटीन crosslinks epitopes और सीमा एंटीबॉडी बाध्यकारी मुखौटा हो सकता है; प्रतिजन पुनर्प्राप्ति ऐसे मामलों में आवश्यक हो सकता है, और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए तरीकों कहीं और 20 से पाया जा सकता है। पीएफए एकाग्रता या निर्धारण की लंबाई अनुभव से प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए और प्रत्येक विकास के चरण में निर्धारित इष्टतम शर्तों के साथ, मिलान मास्किंग कम करने के लिए कम किया जा सकता है। प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में पूर्व प्रतिरक्षा सीरम और एक "कोई प्राथमिक एंटीबॉडी" सह सहित एक नई एंटीबॉडी या हृदय उत्परिवर्ती, निस्र्पक जब उचित नकारात्मक नियंत्रण इस्तेमाल किया जाना चाहिएntrol। पीटा चूहों का प्रयोग एक आदर्श नकारात्मक नियंत्रण है लेकिन जल्दी मारक यहां अध्ययन जीन उत्पादों के कई के लिए उनके उपयोग को रोकता है।
पर्याप्त संस्करणों का प्रयोग पूरी तरह से एक ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस अवरुद्ध, एंटीबॉडी में प्रयोगात्मक और नियंत्रण स्लाइड डूब, और समाधान करने के लिए वर्गों की वर्दी प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए ऊष्मायन के दौरान स्लाइड्स की कोमल कमाल था के रूप में धोने के समाधान के लिए महत्वपूर्ण था। यह दृष्टिकोण एक प्रयोग के भीतर वर्गों और स्लाइड के बीच धुंधला में तकनीकी परिवर्तनशीलता कम से कम। लागत एंटीबॉडी समाधान मात्रा को सीमित करता है, जब ऊतक वर्गों से परे समाधान के प्रवाह को सीमित करने और लंबे समय incubations के दौरान एक humidified कक्ष में स्लाइड्स रखने के लिए एक पैप कलम का उपयोग करें। एक मोनोक्लोनल माउस प्राथमिक एंटीबॉडी हैं - और इसलिए एक विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी - इस्तेमाल किया जा रहा है, अंतर्जात माउस इम्युनोग्लोबुलिन कवर करने के लिए एक दूसरे अवरुद्ध कदम अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत कम करने के लिए आवश्यक (3.4 कदम) हो जाएगा।
उपयुक्त माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण तकनीकों जैविक रूप से सटीक जानकारी 21 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रत्येक रंग के लिए - (एक 16-बिट छवि के लिए 65535 का स्तर 0) तीव्रता हिस्टोग्राम प्रत्येक तीव्रता के स्तर पर पिक्सल के वितरण इंगित करता है। पृष्ठभूमि, चमक, और इसके विपरीत हिस्टोग्राम शिखर flanks कि एक तीव्रता प्रदर्शन रेंज की स्थापना से समायोजित किया जा सकता है; स्थितियों के बीच वैध तुलना करने के लिए, नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों के बीच एक ही सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल देशी भ्रूण माउस दिल में cardiomyocyte परिपक्वता और विकास का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। Cardiomyocyte-विशिष्ट प्रोटीन की इम्यूनोफ्लोरेसेंस अक्सर विकास के दौरान cardiomyocytes चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, वहीं कुछ अध्ययनों उच्च संकल्प myofibril संरचना का विश्लेषण और intercalated डिस्क और costameres 12-14,22,23 के उद्भव की अनुमति है कि तकनीक को रोजगार। इस तकनीक वी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसंरचनात्मक असामान्यताओं के तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है कि cardiomyocyte परिपक्वता में परिवर्तन की पहचान करने का एक साधन के रूप में, विकासात्मक दिल दोषों का कारण है कि परिवर्तन के इवो आकलन।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 7x 7 mm | Richard-Allen Scientific | 58949 | This size not available from Fisher Scientific |
| Cryomold, Disposable Base Mold, 15 x 15 mm | Fisher Scientific | 22-050-159 | Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950 |
| Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583 | VWR | 25608-930 | |
| 2-methyl butane | Sigma | M32631 | |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | T353-500 | Use fresh 4% solution in 1x PBS, pH 7.2-7.4. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Use 15% and 30% solutions in 1X PBS. |
| Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | S30467-1 | |
| Superfrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | "Plus" indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide. |
| Acetone | Sigma | 179124 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Western Blocking Agent | Roche | 11921673001 | Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1x in PBS. |
| Tween 20 | Sigma | P9416 | |
| Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment | Jackson ImmunoResearch | 715-007-003 | Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins. |
| Anti-s-α-actinin antibody | Sigma | A7811 | Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-βcatenin antibody | Cell Signaling | 9587s | Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400. |
| Anti-β1 integrin antibody | R&D | AF2405 | Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-tropomyosin antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | CH1 | Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-N-cadherin antibody | Santa Cruz | sc-7939 | Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue. |
| Anti-talin antibody | Sigma | T3287 | Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment. |
| Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody | Invitrogen | 700255 | Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500. |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-21202 | |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody | Life Technologies | A10042 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A-11001 | |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody | Life Technologies | A-11011 | |
| Hoechst 33342 dye | Life Technologies | H3570 | Nuclear stain |
| Vectashield | Vector labs | H-1000 | |
| Coverslips | Fisher Scientific | 12-548-5M | |
| MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box | Keysight (formerly Agilent) | ||
| Clara Interline CCD camera | Andor | ||
| Eclipse Ti inverted microscope | Nikon | ||
| CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit | Yokogawa | ||
| CFI Plan Apochromat 4X air objective | Nikon | Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm | |
| CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602) | Nikon | NA 1.4, WD 0.13 mm | |
| NIS Elements Imaging Software | Nikon | http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm | |
| Image analysis software | Fiji | http://fiji.sc/Fiji |
References
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