Summary
Burada, bir proof-of-prensibi iki değerlikli adenovirüs tip 5 (Ad5) vektörü oluşturmak için bir protokol mevcut Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi kullanılarak. Bu vektör nitel uygunluk arzettiği gösterilmiştir, yetenek dahil antijenlere Ad5-pozitif in vitro sera'yı ve antijenikliği yanı sıra immünojenitesini kaçmak için.
Abstract
Adenovirüs serotip 5 (Ad5) yoğun aşı gelişimi için geleneksel bir transgen yöntemleri ile modifiye edilmiştir. Klinik çalışmalarda bu geleneksel modifiye Ad5 vektörlerin azaltılmış etkililiğin öncelikle nüfusun çoğunluğu arasında Ad5 önceden varolan bağışıklık (PEI) ile ilişkili olabilir. Ad5 PEI endişe çözerek Ad5-vektörlü aşı gelişmesini teşvik etmek, yenilikçi Antijen Kapsid-Kuruluş strateji istihdam edilmiştir. Bu stratejinin liyakat, biz ilk hekson mekik inşa Ad5-vektörlü plazmid HVR1-Kwas-HVR5-His önceden yapılmış mekik plazmid HVR5-His 6 / pH5S içine aşırı değişken bölgesi (HVR) Hexon 1. altklonlanmasıyla 6 / pH5S, His 6 etiketi HVR5 dahil vardı. HIV epitopu ELDKWAS ihtiva eden bu HVR1 DNA fragmanı elde edilmiştir. HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S sonra doğrusallaştırılmış ve doğrusallaştırılmış omurga plasmid pAd5 / ΔH5 (GL) ile birlikte transforme edilmiş olanHomolog rekombinasyon için. PAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 hücrelerine transfekte edilmiştir Bu rekombine plazmid, viral vektör Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 oluşturmak için. Bu vektör, viral bir fiziksel titre (VP / ml) ile belirtilen niteliksel uygunluğu, enfeksiyonlu titre (IP / ml) ve karşılık gelen VP / IP oranına sahip doğrulandı. Hem HIV epitopu ve O'nun 6 etiket yüzey maruz Ad5 kapsitinde vardı ve kendi epitop özel antijenisiteyi korudu. Bir nötralizasyon deneyi in vitro Ad5-pozitif serumlar ile nötralize aşmak için bu iki değerli vektörü yeteneğini gösterdi. Fare aşılama HIV epitopu ve 6 His için güçlü bir humoral bağışıklık spesifik oluştuğunu gösterdi. Bu proof-of-prensibi çalışma Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi ile ilişkili protokol fizibil farklı kapsid proteinleri değiştirerek Ad5-vektörlü aşıların üretimi için kullanılabilir öne sürdü. Bu protokol, hatta f olabilirurther nadir serotip adenovirüs vektörlü aşıların üretimi için de uyarlanabilir.
Introduction
İnsan adenovirüs (Ad), bir çift sarmallı DNA genomunu ihtiva eden bir ikosahedral nükleokapsid sahip bir orta büyüklükte olmayan zarflı bir virüstür. Reklam Yedi gruba bir sınıflandırmaya (G ile A), Adenoviridae familyasına aittir. Her grup farklı serotiplerin virüs içeriyor. Grup C adenovirüs, hangi serotip 5 (Ad5) en yoğun çalışmalar yapılmış ve en yaygın gen tedavisi ve aşı gibi vectored yaklaşımlar uygulanmaktadır.
Geleneksel transgen stratejisi geliştirildi ve gen-faiz ile virüs erken genlerin değiştirmesi ile karakterize Ad5 değişiklikler, uygulanan ve gen-faiz bir ev sahibi odaklı ifadesi olmuştur. Örnekler Simian İmmün Yetmezlik Virüsü 1 rev geni ile erken gen 3 (E3) değiştirerek pENV9 / Ad5hrΔE3 inşaat olan İnsan Bağışıklık Yetmezliği ve gag geni ile erken gen 1 (E1) değiştirerek AdCMVGag inşaatıVirüs (HIV) 2 ve lac Z geni 3 E1 değiştirerek Reklam lac Z yapımı. Ad5 geleneksel transgen stratejisinin geniş uygulama şu esasa bağlıdır: Ad5, virüs ve virüs yayılması üzerine uygulanabilir gen mühendisliği, yabancı gen ucun geniş konaklama ve Ad5 4,5 güvenliği için barındıran geniş. Ancak, bu stratejinin kullanımı ile Ad5-vektörlü klinik tedavilerin azalmış etkililiğin Ad5 çocuklar ve yetişkinler 4,6 çoğunluğu arasında çok yaygın olduğundan, öncelikle Ad5 PEI ile ilişkili olduğu eşlenmiş olan büyük bir darboğaz olmuştur.
Ad5 önemli darboğazı aşmak için, temel amacı Ad5 PEI engellemeyi alternatif bir strateji geliştirmektir. Bu tür nötralize edici antikorlar (yakalar) 8-10 ve CD8 + T hücresi tepkilerinin olarak doğuştan gelen bağışıklık 7, adaptif bağışıklık Ad5 karşı 10 birlikte gösterilmiştirAd5 yakalar Ad5 PEI 10,11 katkıları baskın rol oynamaya görünen ile Ad5 PEI ntribute. Dahası, Ad5 ana protein Hexon, lif ve penton tabanı dahil kapsid proteinleri bulunan hedef epitopları, yakalar. Hangi Of, hekson Ad5 yakalar 8,11-13 önemli hedefidir. Bu bulgulara dayanarak, yenilikçi Antijen Kapsid-Kuruluş strateji girmiştir. Bu yeni strateji, nötralizan antikorların ve verimli Ad5 vektör idareleri azalarak tanınması lider, proteinlerin-faiz Ad5 nötralize epitoplarını vardiya veya maskeleri Ad5 kapsid proteinleri üzerinde değiştirilmesini ya da birleştirilmesini vurgulamaktadır. Aynı zamanda ana doğrudan bağışıklık sistemine 4,14,15 kadar antijenler-faiz sunarak sağlam humoral bağışıklığı ve güçlü hücresel bağışıklığı ortaya çıkarmak yardımcı olabilir, çünkü bu strateji rekabetçi olması dikkat çekicidir. Bu strateji dayanarak, moleküler klonlama ve yeniden birleştirici Reklam viral vektör, bir kurtarma yapısal ayrılabilirdört ana adımlar (a) ya da polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ya da sentez ile gen-faiz fragmanının hazırlanması; (B) bir adenovirüs omurgasına gen bölgesinin çıkar fragmanını ve homolog kollar ihtiva eden bir mekik plazmidinin gen fragmanının ligasyonu; (C) homolog rekombinasyon ko-transforme doğrusallaştırılmış plasmid omurgası pAd5 / ΔH5 (GL) 16 gen-faiz fragmanını ihtiva eden plasmid Servisi; (D) doğrusallaştırılmıştır rekombinant adenoviral plazmid transfeksiyon antijenleri-faiz ile birleşmiş rekombinant Reklam vektör kurtarmak için.
Grubumuzun ve bazıları farklı bulaşıcı patojenlere karşı İlan vectored aşı geliştirilmesi için bu alternatif reklam birleşme stratejisi artırdık. Bir rekombinant Ad vektör üretilmesini bildirdi Ad-HVR1-LGS-His Ad5 hekson (hexon5) arasında HVR1 yereli bir His-etiketli, HIV-1 antijeni V3 içeren 6 -V3. Bu oluşturulan vektör str tetiklediV3 epitopa 4 özgü Ong humoral immün tepkisi. Ayrıca hexon5 2 HVR2 yereli olarak HIV-1 zara yakın ekto bölge (MPER) eklenerek Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1 gelişimini bildirilmiştir. Buna ek olarak, Dr. Zhou'nun grup Reklam serotip 3 (Ad3) vectored aşılar, yani. Geliştirmek için bu Reklam kuruluş stratejisinin yararları kullandı, Reklam-3'te of HVR1 içine enterovirus 71 nötralize edici epitopu SP70 dahil ederek viral vektör R1SP70A3 nesil hekson (hexon3). R1SP70A3 Enterovirüs 71 meydan 15 karşı koruma yüksek oranda kurşun epitop SP70 özgü güçlü yakalar ve IFN-γ üretimini, üretilen.
Teknik başvuru amacıyla, bizim çalışmamız HVR1 içine HIV-1 antijeni içeren bir iki değerli Ad5 vektörü Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 nesil odaklanmak niteliksel Antijen Kapsid-Kuruluş stratejisi yararlandı birda hexon5 ve HVR5 içine His etiketi. oluşturulan viral vektör, ayrıca immünolojik değerlendirilmiştir. Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi farklı bulaşıcı hastalıklara karşı Ad5-vektörlü aşılama yaklaşımlarının geliştirilmesi yönünde yararlanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Onaylı protokol numarası 101109272 altında burada tarif edildiği gibi Birmingham Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi University of Alabama farelerin kullanımını onayladı.
1. Genetik Construction Modifiye Plazmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi
- Mekik plazmid inşaatı HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S
- Hexon5 geninin Accl için sınırlama enzimi noktalan Agel ile sentezlenen DNA dizisi, HVR1-Kwas ihtiva eden bir plasmid sipariş.
- 37 ° C'de 3 saat enzimler Agel (6 adet) ve Accl (6 adet) sentezlenen parçası (HVR1-Kwas) 6 ug Digest. Elektroforez ile% 2 agaroz jeli içinde dijeste fragmanının gidermek ve üreticinin protokolüne uygun olarak bir DNA jel özütleme kiti ile fragmanı arındırmak.
- Ekin molar oranına göre 3 vektör: 1, T4 DNA ligazı ve ligaz b kullanımıUffer önceden yapılmış mekik plazmidinin 100 ng fragmanı (HVR1-Kwas) 12 ng bağlanması için HVR5-His 6 / pH5S 2 st için oda sıcaklığında bir 10 ul hacim içinde 17, Agel ve Accl siteleri ile.
- (1800 V) bir elektro-içinde elektro DH5α hücreleri 50 ul ligasyon ürünün 10 ul: 1 ul dönüşümü. Dönüştürülmüş DH5α hücrelerine SOC ortamı 950 ul ilave edin ve 300 rpm, 37 ° C'de 1 saat süreyle inkübe karışımı. Kanamisin içeren Luria-Bertani (LB) agar üzerinde 1 mi karışımının 100-200 ul yayıldı ve 37 ° C 'de O / N inkübe edin.
- ~ Fragmanı HVR1-Kwas hedefleme PCR ile 10 koloniler taranması için, ileri primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) karışımı (üreticinin protokolüne göre) bir PCR master karışım çözeltisi içine primer (GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC) ve tek bir koloni DH5α tersine çevirir. PCR master mix çözümü ile sağlanan kılavuza bakarak bir termalcycler örnekleri çalıştırın.
- Bölüm 1.1.4.1 gösterildi klonlarda fragmanı HVR1-Kwas sıralamak için ileri primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) kullanın.
- Plazmid pAd5 / İnşaat H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
- Özet 6 ug HVR1-Kwas-HVR5-His 6/37 ° C 'de 3 saat süre ile enzimleri EcoRI (6 adet) ve Pmel (6 adet) ile pH5S ve homolog rekombinasyon kolları ve çift modifiye hexon5 geni ihtiva eden fragmanı saflaştırılması, olarak adım 1.1.2 belirtti. Omurga plazmid SwaI ile pAd5 / ΔH5 (GL) 16 Linearize.
- Servisi plazmidden hedef fragmanın 100 ng ve (1800 V) bir elektro-homolog rekombinasyon için elektro BJ5183 hücreleri 50 ul halinde doğrusallaştırılmış pAd5 / ΔH5 (GL) omurgası 100 ng Co-dönüşümü. Dönüştürülmüş hücreler SOC ortamında 950 ul ilave edin ve 37 ° C, 300 rpm'de 1 saat süreyle inkübe karışımı. 1 ml karışımı 200 ul - 100 Yayılı37 ° C 'de O / N inkübasyon için kanamisin (son 50 ug / ml) ihtiva eden LB agar üzerine.
- Al ~ 3 ml 10 küçük koloniler, bir çalkalayıcı (250 rpm, 37 ° C) O / N inkübasyon için kanamisin (son 50 ug / ml) ihtiva eden sıvı LB. Kültürden plazmidler ekstrakte edin. Aşama 1.1.4.1 'de gösterildiği gibi, bu parçanın HVR1-Kwas hedefleyerek 10 koloniler taranması için PCR analizi kullanın.
- Omurga genomunun pIX fragmanının hedef PCR analizi, aynı koloniler taranması için, ileri primer (AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT) karışımı, (imalatçının protokolüne göre) bir PCR master karışım çözeltisi içine primer (CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT) ve tek bir koloni BJ5183 tersine çevirir. PCR master mix çözümü ile sağlanan kılavuza bakarak bir termalcycler örnekleri çalıştırın.
- PAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 PCR çift pozitif koloniler atayın.
- Plazmidden pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 100 ng TransformAşama 1.1.4 'de gösterildiği gibi hücre DH5α için.
- Aşama 1.1.4.1 'de gösterildiği gibi, parça HVR1-Kwas hedefleyerek ~ 10 koloniler taranması için PCR analizi kullanın.
- Aşama 1.2.2.2 'de gösterildiği gibi, omurga genomunun pIX fragmanının hedef aynı koloniler taranması için PCR analizi kullanın.
- PAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Parçanın HVR1-Kwas sıralamak için ileri primer (TATGTGTGTCATGTATGCGT) kullanın.
Modifiye Ad5 Viral vektör Ad5 / 2. Hazırlık H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
- Yüksek glukoz DMEM içine FBS (son% 10), 100X Esansiyel Olmayan Amino Asitler (nihai 0.1 mM), 200 mM L-glutamin (son 2 mM), penisilin / streptomisin solüsyonu (son% 1) ilave edilerek tam orta Teşkil . (% 85 nemli koşullar altında 37 ° C ve% 5 CO2), bir kültür inkübatörü içinde tam bir ortam içinde, insan embriyonik böbrek (HEK293) hücreler koruyun.
- Viral ziyaretinde Kurtarmactor Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6
- Tam ortam ve kültür O / N 5 ml ihtiva eden bir T-25 balon içinde Tohum HEK293 hücrelerine 3.0 x 10 6% 80 birleştiği bir tek tabaka elde etmek.
- 15 ug Linearize pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 3 saat süreyle 37 ° C'de sınırlama enzimi Pacl (15 birim) ile 100 ul hacim içinde.
- Özü doğrusallaştırılmış pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 fenol eşit hacimde (1 dakika süre ile 10,000 x g) iki kez reaksiyona santrifüjle: kloroform: bir davlumbaz izoamil alkol (: 24: 1 25 ° oranında) ve karışık bir çözelti (% 100 etanol içinde 300 ul sodyum asetat 10 ul) ve% 70 etanol içinde 700 | il ardışık santrifüjleme (10 dakika süre ile 10,000 x g). Her santrifüj adımında süpernatant atın.
- Saflaştırılmış plazmid damıtılmış su veya Tris-EDTA (TE) tampon maddesi 40 ul yeniden süspanse edin. Optik DE ölçülmesiyle plazmid DNA Miktarınınnsity 260 nm'de (OD).
- Üreticinin kılavuzuna göre, T-25 balonuna ticari lipozomal transfeksiyon reaktifi ile doğrusallaştırılmış plazmidin 3 ug transfekte. 6 saat kültürü inkübatör post-transfeksiyon ve daha sonraki kuluçka de tam orta transfeksiyon ortamı değiştirin. Bireysel viral plaklar oluşana kadar, her iki veya üç gün tam orta yerine transfekte hücreleri koruyun.
- Plaklar, tam bir sitopatik etki (CPE) geliştirmek zaman, steril bir muhafaza içinde bir şişe üzerinde kalan hücreler kazıma ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hasat orta hücre lizatı. % 2 FBS içeren ortama ~ 1 ml hücre pelletini Askıda ve donma-çözülme dört kat hücreleri bölünürler. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüje tabi tutulmasımn ardından lizat kurtarılan virüs içeren süpernatan toplamak.
- Viral vektör Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Büyük ölçekli yayılım
- Th yaymakT-25 balonuna tam lizat 1/3 ile enfekte steril bir muhafaza içinde HEK293 hücreleri ihtiva eden bir T-75 balon içinde E virüsü. Tam CPE kültürü inkübatör 2-3 gün içinde geliştirmeye olanak sağlar. Adım 2.2.5 belirtildiği gibi lizat süpernatant hasat.
- Virüs yayılma koşullarına bağlı olarak, T-75 balonuna tam lizat 1/2 ile enfekte steril bir muhafaza içinde 1-3, T-175 şişelerinde virüsü yayar. Tam CPE kültürü inkübatör 2-3 gün içinde geliştirmeye olanak sağlar. Adım 2.2.5 belirtildiği gibi lizat süpernatant hasat.
- Önceki T-175 şişesi (lar) tam lizat 1/2 ile enfekte steril bir muhafaza içinde bir düzine veya daha fazla T-175 şişelerinde virüsü yayar. Virüs çoğaltma koşulları ve ihtiyacı olan virüs miktarı göre bir şişe, kullanım miktarını belirler. Tam CPE kültürü inkübatör 2-3 gün içinde meydana geldiğinde adım 2.2.5 belirtildiği gibi lizat süpernatant hasat.
- Purifsezyum klorür Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 ication
- 5 mM HEPES, CsCl çözümleri iki yoğunlukları hazırlayın: 1.33 mi g / ve 1.45 g / ml CsCl ile temas gelmesini de önler.
- CsCl yük 4 mi steril bir ultra santrifüj tüpüne (1.33 g / ml) ve hafifçe tüpün dibine CsCl 4 ml (ug / ml 1.45) yükleyin. Yük yavaş yavaş steril kaput geçişlerini üstüne lizat süpernatant 4 ml.
- Kusurlu / yüksek virüs banttan olgun / alt virüs bandı ayırmak için 4 ° C'de 3 saat boyunca 110.000 xg'de tüp santrifüj. Bir 33 G iğne ile donanmış bir 3 ml'lik bir şırınga kullanılarak alt bant toplayın ve steril bir muhafaza içinde 4 ml hacim içinde 5 mM HEPES ile bant seyreltin.
- Aşama 2.4.2 de tarif edildiği gibi, iki CsCl çözeltilerinin yoğunlukları ve virüsün seyreltildi bant ile bir tüp yerleştirin. 4 ° C'de 110,000 x g, O / N tüpü santrifüjleyin. Aşama 2.4.3 tarif edildiği gibi viral bant toplayın.
- Bir dialys toplanan virüs çözümü enjekteSteril kaput içinde 33 G iğne ile silahlı 3 ml şırınga ile kaset olduğunu.
- 1x diyaliz tamponu 700 ml kaseti yerleştirin (1 L tarifi: 10x PBS 100 mi,% 100 gliserol, 100 ml damıtılmış su, 800 mi, 0.22 um'lik bir filtreden filtre tamponu) ve diyaliz tamponu yerine her 3 4 kez saat. Iğneli şırınga ile diyaliz virüs çözümü dışarı aspire.
Kurtarılan Viral Vector 3. Doğrulama
- Viral vektör Titrasyonları
- 10 ve 1: Virüs Fiziksel titresi için, virüs ve 1 diyaliz tamponu (arka plan kontrolü) hem seyreltilmiş virüs liziz tamponu içinde 20 (% 10 SDS Tris-EDTA), küçük tüplere ve 56 ° C 'de tüm tüpler inkübe 10 dk.
- Bir biophotometer açın ve OD 260 nm'de absorbans modunu ayarlayın. "Boş" altını tıklayarak arka plan sinyalini dengelemek için: seyreltilmiş diyaliz tamponu (10 1) kullanın. Biophotometer scr yazın "10 + 90"een ve seyreltilmiş virüsün sinyali (: 10 1) okuyun.
- Adım 3.1.2 yöntemi takip ederek, ancak bunun yerine biophotometer ekranında "5 + 95" tür: seyreltilmiş virüs sinyali (20 1) okuyun. 1.1x10 12 iki virüs okuma numaraları çarpın ve iki dilüsyonları iki ayrı titreleri göre VP / ml gibi bir birim olup ortalama titresi hesaplanır.
- Virüs bulaşıcı titresi (IP / ml) için, 10 gün sonrası enfeksiyon HEK293 hücreleri üzerinde enfeksiyon derinliğini belirlemek için Karber istatistiksel TCID 50 yöntemi 14 kullanın (dpi)
- Viral vektör üzerindeki antijenik maruz ekran Değerlendirilmesi
- Kat bir ELISA plaka viral vektör, ve standart bir ELISA yöntemi 14 adımların geri kalanı ile devam eder. Dahil antijenler 14 karşılık gelen saptanması için insan anti-gp41 (2F5) monoklonal antikoru (mAb) ve fare anti-His etiket mAb kullanın.
- Bir denatu viral vektör gidermekKırmızı protein jel elektroforezi (SDS-PAGE) ve standart bir Western Blot yöntemi 14 adımların geri kalanı ile devam eder. Dahil antijenler 14 karşılık gelen saptanması için insan anti-gp41 (2F5) monoklonal antikoru (mAb) ve fare anti-His etiket mAb kullanın.
- Ad5-Positve serumları atlamasına yeteneği vektörün in vitro değerlendirilmesi
- Kültür inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2 altında 85% nemli koşullar) 'de tam bir ortam içinde HeLa hücrelerinin koruyun. FBS (son% 10), 200 mM L-glutamin (son 2 mM) ve minimum gerekli ortam (MEME) içerisine penisilin / streptomisin solüsyonu (son% 1) ilave edilerek tam orta oluşturuyor.
- 1x10 6 hücre 6 oyuklu plakalarda Tohum HeLa hücre / kuyu ve 2 saat süre ile kültürü inkübatör (37 ° C ve% 5 CO2 altında 85% nemli koşullar) 'de inkübe edin. (Viral vektör 5 IP / hücre ile Ad5-pozitif serumları (0.1 ul veya 0 ul) inkübeAd5, veya Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 1 saat boyunca kültürü inkübatöründe 6) hücreleri ihtiva eden 6 oyuklu plakalar üzerine karışımları ilave edilmeden önce.
- 24 saat (HPI) enfeksiyondan de, liziz tamponu içinde 0.5 ml bir kez PBS ile lize hücreleri ile yıkayın. 5 dakika boyunca 15.000 xg'de Santrifüj ve süpernatant toplamak. Virüsler, lusiferaz genini içerir, çünkü lusiferaz sinyali okumak için lusiferaz alt-tabaka 100 ul süpernatan 20 ul karıştırın.
Kurtarılan Viral Vector 4. İmmünolojik Değerlendirilmesi
- Ad5 ve Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6: İki aşı grupları hazırlayın.
- 2 haftalık bir arayla, bir homolog "ana-yükleme" bağışıklama rejiminde, 1x10 10 VP / fare olarak virüsleri ile kas içinden (n = 8 / grup) fareler enjekte edilir.
- 2 hafta her enjeksiyon sonrası anda, hayvan lancets (5 mm uç uzunluğu) ile birlikte kanama yanak tarafından anestezi olmadan farelerin kanama1.5 ml tüpler kan almak.
- Aşağı çevrilerek ve boruların kan karıştırın ve 30 dakika için oda sıcaklığında kan inkübe edilir. 5, 4 ° C'de minimum ve yeni bir 1.5 ml'lik tüplere transfer sera (üst katman) için 10,000 x g'de tüpler dönerler.
- 5, 4 ° C'de dakikada ve transfer sera için 10,000 x g'de yeni tüplere Spin yeni -80 ° C'de depolama için 1.5 ml tüpler işaretlenmiş.
- Sera dayalı ELISA ile antijen-spesifik humoral bağışıklık Değerlendirilmesi
- His peptit (1 mM stok) ve HIV-1 peptit (1 mM stok), ayrı ayrı 100 içinde seyreltilir.
- mM karbonat tamponu (pH 9.5), 10 uM peptit kaplama konsantrasyonu elde etmek için. Coat ayrı 4 ° C'de plakalar O / N oyuk başına 100 ul ilave edilmesi ve kuluçkalama ile seyreltildi peptidlerle ELISA plakaları.
- PBST içinde% 5 BSA içinde 1 saat süre ile 200 / çukur ul ve blok dört kez PBST ile plakalar, yıkama. 1 de plakalarına fareler sera uygulayın: 100 seyreltme engelleme buf içindefer, 100 ul / yuva. Oda sıcaklığında 2 saat inkübasyondan süreyle inkübe edin.
- Dört kez PBST ile plakalar, yıkama. / Oyuk 100 ul bloke edici tampon içinde, 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek plakalar bloke eder.
- 100 ul / oyuk bireysel His peptid ve HIV-1 peptit ile kaplanmış plakalar hem: (bloke tampon maddesi içinde 5.000 1) keçi anti-fare IgG-HRP uygulanır. Oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edin. PBST ile plakalar, yıkama.
- 30 dakika boyunca HRP alt-tabaka ile inkübe edildikten sonra OD450 nm plakaları okuyun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antijen kapsid-ekleme stratejisinde (Şekil 1A) iki değerlikli Ad5 viral vektörü Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 oluşturmak için kullanılmıştır. Öncelikle, mekik plazmid HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S önceki inşa mekik plazmid HVR5-His 6 / pH5S 17 içine HVR1-Kwas fragmanı altklonlanmasıyla inşa edilmiştir. İkinci olarak, plazmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 "EcoRI-HVR1-Kwas-HVR5-His6-Pmel" bir kısmı ve SwaI-doğrusallaştırılmış pAd5 / ΔH5 arasındaki homolog rekombinasyon ile oluşturulmuştur (GL ) 16 (Şekil 1B). Pacl transfeksiyonu sindirilmiş pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His viral vektör Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 14 kurtarmaya T-25 şişesi kurşun 6. kurtarılan virüs vektör daha sonra büyük ölçekli yayılır ve CsCI gradyanı ultrasantrifüjdeki iki döngü ile saflaştırılmıştır.
AmacıylaAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6, fiziksel titre viral genomun fiziksel kopyalarını ölçerek / ml 1.3 x 10 11 VP saptandı kurtarıldı viral vektör canlılığı / uygunluğu göstermek ve bulaşıcı titresi oldu Gerçek bulaşıcı viral partikülleri titre edilerek 1.4 x 10 9 IP / ml tespit edilmiştir. VP / IP oranı, daha sonra 92 14. Normal olarak hesaplandı, 1000 altında bir VP / IP oranına sahip bir Ad Bu virüsün niteliksel uygunluk gösterir. Bu kurtarılan virüs antijenik HIV antijeni ve viral kapsid ana protein hexon5 yüzeyi üzerinde, sırasıyla His etiketi görüntüler olmadığını göstermek için, ELISA, sırasıyla insan 2F5 mAb ve fare anti-His etiket mAb ile gerçekleştirilmiştir. Sonuçlar yoktu, oysa hem insan 2F5 mAb (Şekil 2A) 14 ve fare anti-His etiket mAb (Şekil 2B) 14, Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 bağlanma gösterdi göstermiştir olumsuz contro bağlanabilenl vektör Ad5. Western-blot analizi, sadece virüs Ad5 hem de insan 2F5 mAb (Şekil 2C) 14 ve fare anti-His etiket mAb (Şekil 2D), 14 tespit edilen, ELISA verileri teyit etmek için 117 kDa etrafında belirli bantlar kullanılmıştır / H5- HVR1-Kwas-HVR5-His 6, hexon5 protein boyutuna karşılık gelir. Potansiyelini değerlendirmek amacıyla Ad5 / protokol bölümünde 3.3 belirtildiği gibi H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Ad5-pozitif serumlar ile nötralize engellemeyi de, nötralizasyon deneyi analizi gerçekleştirildi. Sonuçlar, göreli ışık yayma birimi Ad5-Positve serumun 0 ul muamele edilmiş viral vektör Ad5 den (RLU) sinyali Ad5-Positve serumların 0.1 ul (p değeri <0.001 ile tedavi edilen aynı vektör ile ilgili daha 12 kat daha yüksek olduğunu göstermiştir ). Bu Ad5-positvive sera tarafından vektörün Ad5 nötralizasyonunu önerdi. Bunun aksine, viral vektör Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 arasında çok az fark vardı0 ul ve Ad5-Positve serumların 0.1 ul (Şekil 3) ile işlemden geçirildi. Hekson nötralize epitoplar Hexon 12,18 tüm HVRlerin ikamet büyük İlan nötralizan antikorların hedef ve hekson özgü olduğundan, veri yukarıdaki Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 Ad5-positve sera tarafından nötralize kaçtı olduğunu göstermiştir potansiyeli in vitro ve önerilen Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 konakta Ad5 PEI engellemeyi üzerinde.
Antijen Kapsid-Kuruluş stratejisi ile değiştirilmiş iki değerli Ad5 viral vektör dahil antijenlerin-faiz özgü sağlam humoral bağışıklığı ortaya olabilir olup olmadığını araştırmak için, "prime-boost" bağışıklama rejimi kontrolü viral vektör Ad5 ve farelere bağışıklık uygulandı çift değerli vektörü Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. HİV-1 peptidi ile kaplanmıştır Sera tabanlı ELISA Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 bağışıklık gruptan sera significan olduğunu göstermiştirKontrol grubu (p değeri <0.001) (Şekil 4A) 14 gelen sera ile karşılaştırıldığında T, 40 ve 640 arasında seyreltmelerde, HIV-1 peptit bağlanması. Onun peptid ile kaplanmış ELISA Sera tabanlı kontrol grubuna gelen sera ile karşılaştırıldığında Ad5 / aşılanma gruptan sera h5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 istatistiksel p değeri olarak, His peptidine bağlama belirgin olduğunu göstermiştir < 320 seyreltmede (Şekil 4B) 14 160 ve p değeri <0.05 seyreltide 40 ve 80, p değeri <0.01 sera seyreltmeleri 0.001. Yukarıdaki sonuçlar, iki değerlikli, viral vektör üzerinde ilave antijenlere karşı humoral immün yanıtı oluşumunu gösterdi.
Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi ile plazmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 genetik yapı Şekil 1. şematik gösterimi. (A) Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi doğrudan antijen-faiz adenovirüs kapsid proteinleri (hekson, penta tabanı, pIX ve / veya lif) görüntülemek ile karakterizedir. Bu rakam, Nemerow uyarlanmıştır ve diğ., 2009 Virology 384 (2009) 380-388, Copyright Elsevier. (B) gen parçası (HVR1-Kwas) sentezlenmiştir ve bir şirket tarafından bir pUC vektörüne klonlanmıştır. Bu fragman HVR5-His sınırlama ile 6 / pH5S Agel ve Accl HVR1-Kwas-HVR5-His 6 / pH5S oluşturmak için enzimleri önce inşa Servisi plazmide alt klonlanmıştır. Elde edilen mekik plazmidi rekombine omurga plasmid pAd5 / H5-HVR1-Kwas üretimi ile sonuçlanan, enzimler EcoRI ve Pmel ve ko-transforme edilmiş SwaI-doğrusallaştırılmış omurga plasmid pAd5 / ΔH5 (GL) ile homolog rekombinasyon için ile sindirildi -HVR5-His 6. Bu şekilde, R1, HVR1 temsil eder ve R5 HVR5 temsil eder, ve GL yeşil floresan proteini (GFP) ve lucife temsil ederrase ayrı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Iki değerli viral vektör kapsid yüzeyinde dahil antijenlerin antijenik maruziyet Şekil 2. Değerlendirme Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His dahil antijenler vektör üzerinde maruz olsaydı ELISA belirlemek amacıyla yürütülmüştür 6. Tüm viral vektör Yüzey kendi antijenik özellikleri korurken. ELISA plakaları çift değerli vektörü ile kaplanmış ve insan 2F5 mAb (A) ya da fare anti-His mAb (B) ile inkübe edildi. Veriler, ancak kontrol vektörü Ad5 için, iki değerlikli vektörüne antikorların önemli bir bağlanma göstermiştir. R1-Kwas-R5-His 6 Ad5 / H5 temsil eder-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Western-blot analizi iki değerlikli vektör üzerinde ilave antijenler insan 2F5 mAb (C) ya da fare anti-His mAb (D) bağlanma antijenik teyit etmek için gerçekleştirildi. Her iki (C) ve (D), şerit 1 Ad5 gösterir ve şerit 2 belirtmek Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ad5-positve sera in vitro. Nötralizasyon testi ile nötralize kaçmak için iki değerlikli viral vektörün yeteneği Şekil 3. değerlendirilmesi iki değerli vektör nötralizasyonun kaçış olabilir olmadığını belirlemek amacıyla yapılmıştır. Sonuçlar sera tarafından Ad5 virüsünün nötralizasyonunu belirtilen ancak esin vitro iki değerli virüsünün nötralizasyonu pelerin. Bu şekilde, R1-Kwas-R5-His 6 Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6. gösterir. yıldız *** p değeri <0.001 belirtir.
Fare modelinde iki değerlikli, viral vektör tarafından humoral bağışıklık canlı ortamda Şekil 4.. ELISA Sera bazlı çift değerli vektörü Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 dahil proteinlere karşı humoral bağışıklığı değerlendirmek için kullanıldı . HIV-1 peptit (A) ve His peptit (B) iki aşı gruplarından fare serası ile inkübasyon, ardından ayrı ELISA plakalarında kaplanmıştır (Ad5 ve Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6) . Veri H, HIV-1 antijenine karşı humoral immün tepkilerinin anlamlı bir nesil belirtilmedikçeVR1 (A) ve HVR5 bölgesindeki His etiketi (B). Her bir veri noktası aracı ve sekiz kez tekrarlanmış olan SD temsil eder. yıldız *** ** p değeri <0.01 gösterir ve * p değeri <0.05 gösterir, p değeri <0.001 belirtir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
aşıların geliştirilmesi için Ad5 değişiklik geleneksel transgen stratejisinin uygulama öncelikle Ad5 PEI 4,6 ile bağlantılı darboğaz için azalmıştır. Bu darboğaz kısmen bu strateji Ad5 nötralizan antikorların tarafından nötralize kaçmasına beri antijenlerin-faiz ile Ad5 ve nötralize epitoplarını değiştirerek, alternatif Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi (Şekil 1A) uygulamasıyla azaldı ve sağlam dokunulmazlık nesil kolaylaştırmak olabilir dahil antijenlerin-of-faiz. Bu çalışmada, modifiye edilmiş iki değerlikli viral vektörün üretimi Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 kavramsal örnek (Şekil 1B) olarak ortaya çıkmıştır. Protokol bölümüne 1.1.1 karşılık gelen sipariş plazmid sentezlenen fragmanı hexon5 arasında HVR1 yerelinde bir HIV-1 gp41 kısa gen ikamesini içerir. Kısmi gp41 geni yerine bir epitop ELDKWAS kodlayanamino asitler hexon5 14 139-144 kısmi HVR1. ELDKWAS, HIV-1 gp41 19 bir güçlü bir nötralize edici epitopu.
Klonlama sırasında iki kritik adımlar vardı. Protokol bölüm 1.1.1 gen fragmanı ilgi sentezlenmesi sırasında bir adım, iki restriksiyon enzimlerinin seçimi yapıldı. iki enzimin seçimi koşullu modifiye edilmesi Reklam kapsid yere, yani bağlıdır. Bu çalışmada, Kwas içeren gen fragmanı hexon5 proteininin HVR1 içine dahil etmek için tayin edildi. Kısıtlama Agel ve Accl N-terminal ve C-terminal HVR1 yereli alanlarını yandan kuşatan ayrı ayrı ana kadar, ve böylece Agel ve Accl tek tek N-terminal ve C-koymak için seçilmiştir fragmanı HVR1-Kwas mevcut olmayan enzimleri Sentezlenen fragmanı HVR1-Kwas terminus. Hekson nötralize edici epitoplar hekson 12,18 her HVRlerin ikamet ana Reklam nötralizan antikorların hedefi ve hekson özgü olduğundan, mümkün olduğunu thAntijen Kapsid-Ortaklık stratejisi ile e hekson modifiye Ad5 vektörleri in vitro Ad5-pozitif serumlar ile nötralize bypass becerisi kazandırmak ve ev sahibi hatta Ad5 PEI olabilir. Bu çalışmada, iki değerli viral vektör hem HVR1 ve HVR5 Ad5-pozitif serumlar ile nötralizasyon kaçış katkıda bulunabilir. diğer kritik adım protokol bölümünde 1.2.2 idi. LB agar üzerine ko-transforme edilmiş karışımın O / N inkübasyondan sonra, yetiştirilen BJ5183 koloni O / N sıvı LB hemen kültüre edilmesi gerekebilir, ve plazmitler hemen yanı BJ5183 hücrelerinden ekstre edilmesi gerekir. BJ5183 hücrelerinde rekombine plazmid stabil olmadığı için prosedürler geciktirmek muhtemelen potansiyel bir rekombinasyon ve mutasyonlar neden olur. Homolog rekombinasyon doğru plazmid istikrarlı ve doğru genom türleri sağlamak için DH5α dönüştürülmesi gerekir.
Klonlama sonra, iki daha kritik adımlar vardı.protokol bölümünde ilk adım transfeksiyon ilgili. Omurga plasmid E1 geni silinmişse, Ad5 E1 (HEK293) eksprese eden hücrelerin birleştirilemeyeceğini Reklam omurga plasmid transfekte etmek gereklidir. protokol bölümünde 2.3 diğer adım virüs yükseltme ilgili. Virüs yükseltme temel prosedür T-75 şişeler ve T-175 matara bir T-25 şişesi standart virüs yükseltme ilkesini izler. Bununla birlikte kullanım için şişeler (T-75 ve / veya T-175) sayısı virüsü, virüs enfeksiyonundan kaynaklanan CPE gelişimi, ve gerektiğinde virüs miktarının büyüme hızına bağlıdır.
Antijen Kapsid-Kuruluş strateji Reklam değişiklikler konusunda geniş bir uygulama sağlar. Bu strateji ile, değiştirmek ya da Hexon 2,4,20, penton tabanı 21 ve lif 22 farklı kapsid büyük proteinler üzerinde heterolog antijenleri dahil etmek mümkündür. kapsid proteini küçük pIX C terminali de heterol için söz gösterdihomolog antijen / peptid dahil 21,23. Tek değişiklik yanı sıra, bu strateji ile Ad birden modifikasyonlar da başarı elde etti. Örnekler iki değerlikli bir kuşak vardır Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 HVR1 ve hexon5 ve HVR5 ve HVR1 ve HVR2 veya HVR1 ve ya içine enterovirus tip 71 iki nötralize epitoplar dahil hem de anonim tarafından bu çalışmada HVR4 veya HVR1 ve hexon3 24 HVR5. Bu örnekler gen tedavisi veya aşılama yaklaşımı ya amacıyla Ad diğer serotipleri de hekson değişiklikler fizibilite, ima. Bizim verilerimiz de Hexon ve Pix (yayınlanmamış veri) İki Trypanosoma cruzi epitopların birleştirmeleri gösterdi. Bu strateji aynı zamanda aşılama ya da gen terapisi yaklaşımları biri için kimerik Reklam vektörleri yapmak için uzatıldı. Örnekler hexon3 16 hexon5 geçerek kimerik Ad5H3 bir kuşak kimerik Ad3H7 üretilmesi hexon3 wi geçerekth 25 hexon7 ve 4'de diğerlerinden farklı lif 26 Ad5 lif değiştirerek kimerik Ad5F4 nesil.
Bu çalışmada, çift değerli Ad5 / H5-HVR1-Kwas-HVR5-His 6 dahil antijenler-faiz özel humoral immün tepkilerinin ortaya çıkarmak gösterdi. Mevcut projesi Asp2 spesifik CD8 T hücresi tepkisi önemli ölçüde Antigen kapsid-kuruluş stratejisi ile, bir protein IX Ad5 bölgesinin (PIX) içine Asp2 peptidi dahil edilmesi ile oluşturulan bir vektör Ad5-pIX-Asp2 ile immünizasyon yoluyla hazırlanmış olduğunu göstermektedir (veriler gösterilmemiştir). Asp2 da amastigot yüzey proteini 2 isimli digenetic hücre içi protozoandır Trypanosoma cruzi (T. cruzi) 27 bir immünodominant antijen olmaktadır. Bu yeni deneysel bulgu Reklam vectored aşılar üzerinde Antijen Kapsid-Ortaklığın stratejisinin uygulanması hücresel immün da sadece humoral bağışıklık tepkiler, ancak bu bilgimizi genişletirantijenlerin-of-faiz belirli e yanıtları.
Geleneksel transgen stratejisine nispeten avantajlı olmasına rağmen, Antijen Kapsid-Ortaklık stratejisi aynı zamanda üç dezavantajları vardır. Birincisi, bu sürece geleneksel strateji yaptığı gibi genin-faiz katılmasına izin veremeyiz. Bu hexon5 Antigen kapsid-ekleme stratejisinde, maksimum 80 amino asit HVR1 (aa), HVR5 77 AA ve HVR2 2 57 aa eklemeleri sağlar bildirilmiştir. Hangi Of, HVR1 birleşme için en müsamahakar yerel olduğunu. Ancak, küçük kapsid proteini pIX 1000 amino asitten 28 bir ekleme barındırabilir. İkincisi, bazı antijenler-faiz doğası nedeniyle Reklam virüsünün yapısal düzenleme bozmak gibi bu tür ücretleri ve amino asitler, güçleri gibi faktörlere Reklam kapsid proteinleri içine dahil başarısız. Bu durumda, uygun aralama giriş th yardımcı olabilir antijenler-faiz bağlantılıE, başarılı dahil 4. Üçüncüsü, bazı HVR yerellerde kuruluşları, yani., HVR6 veya HVR7 canlı viral vektörlerin 12 başarısız nesil yol açabilir. Avantajları ve her iki stratejilerin dezavantajları göz önüne alındığında, her iki stratejilerin iki stratejilerinden bir bilge seçimi veya bir arada belirli koşullar / ihtiyaçlarına bağlı olacaktır. Strateji her iki tarama örneği, Ad5 / HVR2-MPER-L15 (GAG) üretilmesidir, burada zara yakın bir dış bölgesinde Antijen kapsid-kuruluş stratejisi ile hexon5 arasında HVR2 dahil, HIV-1 gp41was bölgesinin (MPER), ve HIV-1 Gag geni geleneksel transgen stratejisi 2 Ad5 E1 geni yerel yerine sokulmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Sağlık 5T32AI7493-20 ve 5R01AI089337-03 hibe Bu eser Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından kısmen desteklenmiştir. fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x DPBS | Thermo Scientific | SH30256.01 | for cell spliting |
| 10x DPBS | Thermo Scientific | SH30378.02 | for dialysis buffer preparation |
| glycerol | SIGMA | G5516-1L | for dialysis buffer preparation |
| SDS | BIO-RAD | 161-0301 | for virus lysis buffer preparation |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermo Scientific | SH30910.03 | component of culture medium |
| 100x Non-Essential Amino Acids | Thermo Scientific | SH30238.01 | component of culture medium |
| 200 mM L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | component of culture medium |
| penicillin/streptomycin solution | Cellgro | 30-002-CI | component of culture medium |
| DMEM with high glucose | Thermo Scientific | SH30081.01 | for HEK293 cell culture |
| Minimum Essential Medium Eagle | SIGMA | M5650 | for HeLa cell culture |
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | SIGMA | P3803-100ML | for large size of DNA purification |
| cesium chloride | Research Products International Corp. | C68050 | for virus purificiation |
| HEPES | Cellgro | 25-060-CI | for CsCl solution preparation |
| HEK293 | ATCC | 51-0036 | for virus rescue and upscale |
| HeLa | ATCC | CCL-2 | for neutralization assay |
| T-25 flask | Thermo Scientific | 156367 | for cell culture |
| T-75 flask | CORNING | 430641 | for cell culture |
| T-175 flask | Thermo Scientific | 159910 | for cell culture |
| Ultracentrifuge | BECKMAN | NA | for virus purification |
| Ultracentrifuge tube | BECKMAN | 344059 | for virus purification |
| dialysis cassette | Thermo Scientific | 66380 | for virus dialysis |
| ELISA plate | Thermo Scientific | 442404 | for ELISA |
| human anti-gp41 (2F5) mAb | NIH AIDS Reagent Program | 1475 | for immunological assays |
| mouse anti-His tag mAb | GenScript | A00186 | for immunological assays |
| SOC medium | CORNING | 46-003-CR | for transformation |
| PCR master mix solution | QIAGEN | 201445 | for PCR |
| Animal lancet (point length at 5 mm) | MEDIpoint | for mice bleeding | |
| Biophotometer | Eppendorf | for virus physical titer titration |
References
- Cheng, S. M., et al. Coexpression of the simian immunodeficiency virus Env and Rev proteins by a recombinant human adenovirus host range mutant. Journal of virology. 66, 6721-6727 (1992).
- Matthews, Q. L., et al. HIV antigen incorporation within adenovirus hexon hypervariable 2 for a novel HIV vaccine approach. PloS one. 5, e11815 (2010).
- DeMatteo, R. P., et al. Long-lasting adenovirus transgene expression in mice through neonatal intrathymic tolerance induction without the use of immunosuppression. Journal of virology. 71, 5330-5335 (1997).
- Gu, L., et al. A recombinant adenovirus-based vector elicits a specific humoral immune response against the V3 loop of HIV-1 gp120 in mice through the 'Antigen Capsid-Incorporation' strategy. Virology journal. 11, 112 (2014).
- Matthews, Q. L., Krendelchtchikov, A. L. G., Li, Z. C. Viral Vectors for Vaccine Development. INTECH. , (2013).
- Tang, D. C., Zhang, J., Toro, H., Shi, Z., Van Kampen, K. R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. Expert review of vaccines. 8, 469-481 (2009).
- Flatt, J. W., Kim, R., Smith, J. G., Nemerow, G. R., Stewart, P. L. An intrinsically disordered region of the adenovirus capsid is implicated in neutralization by human alpha defensin 5. PloS one. 8, e61571 (2013).
- Bradley, R. R., Lynch, D. M., Iampietro, M. J., Borducchi, E. N., Barouch, D. H. Adenovirus serotype 5 neutralizing antibodies target both hexon and fiber following vaccination and natural infection. Journal of virology. 86, 625-629 (2012).
- Zaiss, A. K., Machado, H. B., Herschman, H. R. The influence of innate and pre-existing immunity on adenovirus therapy. Journal of cellular biochemistry. 108, 778-790 (2009).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies and CD8+ T lymphocytes both contribute to immunity to adenovirus serotype 5 vaccine vectors. Journal of virology. 78, 2666-2673 (2004).
- Sumida, S. M., et al. Neutralizing antibodies to adenovirus serotype 5 vaccine vectors are directed primarily against the adenovirus hexon protein. Journal of immunology. 174, 7179-7185 (2005).
- Bradley, R. R., et al. Adenovirus serotype 5-specific neutralizing antibodies target multiple hexon hypervariable regions. Journal of virology. 86, 1267-1272 (2012).
- Gahery-Segard, H., et al. Immune response to recombinant capsid proteins of adenovirus in humans: antifiber and anti-penton base antibodies have a synergistic effect on neutralizing activity. Journal of virology. 72, 2388-2397 (1998).
- Gu, L., et al. Using multivalent adenoviral vectors for HIV vaccination. PloS one. 8, e60347 (2013).
- Tian, X., et al. Protection against enterovirus 71 with neutralizing epitope incorporation within adenovirus type 3 hexon. PloS one. 7, e41381 (2012).
- Wu, H., et al. Construction and characterization of adenovirus serotype 5 packaged by serotype 3 hexon. Journal of virology. 76, 12775-12782 (2002).
- Wu, H., et al. Identification of sites in adenovirus hexon for foreign peptide incorporation. Journal of virology. 79, 3382-3390 (2005).
- Qiu, H., et al. Serotype-specific neutralizing antibody epitopes of human adenovirus type 3 (HAdV-3) and HAdV-7 reside in multiple hexon hypervariable regions. Journal of. 86, 7964-7975 (2012).
- Parker, C. E., et al. Fine definition of the epitope on the gp41 glycoprotein of human immunodeficiency virus type 1 for the neutralizing monoclonal antibody 2F5. Journal of virology. 75, 10906-10911 (2001).
- Farrow, A. L., et al. Immunization with Hexon Modified Adenoviral Vectors Integrated with gp83 Epitope Provides Protection against Trypanosoma cruzi Infection. PLoS neglected tropical diseases. 8, e3089 (2014).
- Krause, A., et al. Epitopes expressed in different adenovirus capsid proteins induce different levels of epitope-specific immunity. Journal of virology. 80, 5523-5530 (2006).
- Omori, N., et al. Modification of a fiber protein in an adenovirus vector improves in vitro gene transfer efficiency to the mouse microglial cell line. Neuroscience letters. 324, 145-148 (2002).
- Dmitriev, I. P., Kashentseva, E. A., Curiel, D. T. Engineering of adenovirus vectors containing heterologous peptide sequences in the C terminus of capsid protein IX. Journal of virology. 76, 6893-6899 (2002).
- Xue, C., et al. Construction and characterization of a recombinant human adenovirus type 3 vector containing two foreign neutralizing epitopes in hexon. Virus research. 183, 67-74 (2014).
- Tian, X., et al. Construction and characterization of human adenovirus serotype 3 packaged by serotype 7 hexon. Virus research. 160, 214-220 (2011).
- Kim, J. W., et al. An adenovirus vector incorporating carbohydrate binding domains utilizes glycans for gene transfer. PloS one. 8, e55533 (2013).
- Vasconcelos, J. R., et al. Pathogen-induced proapoptotic phenotype and high CD95 (Fas) expression accompany a suboptimal CD8+ T-cell response: reversal by adenoviral vaccine. PLoS pathogens. 8, e1002699 (2012).
- Matthews, Q. L., et al. Genetic incorporation of a herpes simplex virus type 1 thymidine kinase and firefly luciferase fusion into the adenovirus protein IX for functional display on the virion. Molecular imaging. 5, 510-519 (2006).
