의 로코 속도에 에탄올의 효과를 측정하는 분석<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em

요약

C. elegans는 에탄올의 행동 영향을 연구하는 데 유용한 모델입니다. 우리는 기어가는 벌레의 운동 속도에 에탄올의 영향을 정량화하는 행동 분석을 제시합니다. 이 분석으로 초기 민감도와 에탄올에 대한 급성 기능적 내성의 발달을 모두 측정할 수 있습니다.

초록

알코올 사용 장애는 효과적인 치료 전략이 거의 없는 중요한 공중 보건 문제입니다. 보다 효과적인 치료법 개발을 지연시킨 한 가지 어려움은 에탄올이 행동에 미치는 영향의 분자적 근거에 대한 상대적인 이해 부족입니다. 선충, Caenorhabditis elegans (C. elegans)은 에탄올의 분자적 효과에 대한 가설을 생성하고 테스트하는 데 유용한 모델을 제공합니다. 여기서 우리는 에탄올에 대한 행동 반응에서 특정 유전자 및 환경 요인의 역할을 조사하기 위해 개발되고 사용된 검정법에 대해 설명합니다. 여기서 행동 출력은 운동입니다. 에탄올은 아가 표면에서의 기어걸음을 급성적으로 억제합니다. 효과는 역동적입니다; 높은 농도에 노출된 동물은 초기 강한 기어걸음 억제, 여기서는 초기 민감성이라고 언급되며, 그 후 약물의 지속적인 존재에도 불구하고 기어걸음 속도를 부분적으로 회복합니다. 이 에탄올 유도 행동 가소성은 여기서 급성 기능적 내성의 발달이라고 언급됩니다. 이 검정법은 이 두 표현형이 구별되고 유전적으로 분리될 수 있음을 입증하는 데 사용되었습니다. 여기서 설명된 직접적인 운동 검정법은 C. elegans에서 유전자 및 환경 조작이 에탄올에 대한 이러한 급성 행동 반응에 미치는 영향을 조사하는 데 적합합니다.

서론

알코올 사용 장애(AUD)는 널리 퍼져 있으며, 심각한 건강, 사회적 및 경제적 문제를 야기합니다. 인간의 경우, AUD 발병 가능성은 유전자와 환경의 영향을 크게 받습니다^1,2. 남용 가능성의 강력한 생리학적 예측 지표는 순수한 음주자가 나타내는 알코올(에탄올)에 대한 초기 반응 수준(LR)입니다^3-5. 이 LR 표현형은 유전자 및 비유전자 구성 요소의 영향을 받습니다⁶. 에탄올에 대한 LR에 영향을 미치는 분자 메커니즘을 결정하는 것은 에탄올 반응 행동 연구의 중요한 목표입니다.

선형동물인 Caenorhabditis elegans는 에탄올이 행동에 미치는 영향을 연구하는 모델로 점점 더 많이 사용되고 있습니다^7-9. 선충과 포유류의 신경계 기능 메커니즘에는 강한 분자적 보존이 있으며, 선충의 에탄올에 대한 LR에 영향을 미치는 것으로 나타난 몇몇 유전자가 포유류의 에탄올에 대한 LR에도 영향을 미치는 것으로 나타났습니다^10-16, 그리고 인간의 남용 가능성과 관련이 있습니다^17-19.

에탄올은 선충을 중독시키며, 이는 선충의 운동 속도 감소로 반영됩니다. ....

프로토콜

분석하기 전에 날에 대해 수행 할 1 단계

1. 신선한 선충 성장 매체에 L4 무대 웜을 선택 (NGM) 판 OP50 E.의 잔디 파종 20 주 / N에서 대장균, 문화를. 각각의 분석 조건 (10) 웜이 필요합니다; 웜의 O / N 손실을 허용하는 웜의 과잉을 선택합니다.
   1. 첫날 성인들만 분석 동물; 많은 돌연변이가 야생형보다 느린 속도로 성장한다. 테스트 한 모든 동물이 처음 일 성인 있도록 발달 지연이 균주에 대한 따기의 타이밍을 조정합니다.

2 단계 분석의 날에 수행하는

1. 분석을위한 준비 :
   1. 표준 시드 화 60 X 15mm NGM 판에 분석을 수행합니다. 판 모두 뚜껑 오프로, 2 시간 동안 37 ℃에서 사용하는 건조. 각각의 실험 시험의 경우, 네 건조 NGM 판을 사용한다; 이들은 0 mM의 400 mM의 에탄올 분석 플레이트 및 동반 적응 판을 것입니다.
      참고 :NGM 플레이트의 사용은 여기에 중요하다 판의 조성의 차이가, 특히 그들의 삼투압에 강하게 행동에 에탄올 용량 반응에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 동물 ^(20)에 의해 축적 된 에탄올의 양의 변화에 적어도 부분적으....

결과

여러 가지 유전자형과 짝을 컨트롤에서 대표 데이터 (그림 1)는 ^8,24을 제시; 데이터는 구체적으로 분석 동물에서 그 하이라이트 차이를 선정 하였다. 노출 10 분으로 영향 정도는도 1B-G의 좌측 축 상에 도시되어 균주의 초기 감도 여겨진다. 10 분으로 제어보다 큰 상대 속도와 변이주가, 에탄올 (도 1F, G) 내성 인 것으로 간주되는 반면 (도 1D 에탄올 과민 것으로 간주 제어보다 작은 상대 속도 변이주, E). 도 1의 오른쪽 축 10 및 30 분 사이의 시간주기의 회수 속도의 정도를 나타낸다. 이것은 급성 내성 기능의 개발 (AFT)의 속도의 측정치를 나타내고, 상대 SPE로부터 감산 10 분으로 상대 속도로서 계산된다30 분에 에디션. 큰 복구 값 균주 (도 1C 대조 동물은 AFT 개발의 낮은 속도를 갖는 것으.......

토론

C.에서 사용할 수있는 간단한 신경 생물학 및 유전 적 도구 엘레 웜 행동에 에탄올의 효과의 분자 기초를 공부하는 우수한 모델합니다. 여기서는 ^{8,10,20,24,25을} 에탄올 급성 행동 반응의 여러 환경 매개체 분자를 식별하는 데 사용 된 분석법을 설명한다. 이 방법은 함께 포유 동물에서 응답의 수준의 복합 표현형 모델, 분화 및 두 개의 서로 다른 에탄올 응답 행동 표현형, 초기 감도와 급성 기능 관용의 개발을 동시에 검사 할 수 있습니다. 동일한 분석을 용이하게함으로써, 다른 약물의 행동 효과의 평가에서 여러 균주를 동시에 시험을 이용하는 다른 약리학 적 제제를 연구하기 위해 적응 될 수있다.

10-12 분의 시간 창에 변형 등의 초기 감도를 측정하는 데 유용한 시각을 제공한다한올. 노출의 처음 10 분에 걸쳐 400 mM의 에탄올 효과의 분석은 노출되지만 실제로 초 분의 정상 상태 속도부터 효과 에탄올 노광 ^.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
C. elegans 균주	Caenorhabditis 유전체학 센터
60 x 15 mm 페트리 플레이트, 세 배 환기	Greiner Bio-One	628161	다른 플레이트 브랜드도 충분합니다.
NGM 아가	다양한		NaCl (3 g/L), 아가 (17 g/L), 펩톤 (2.5 g/L), 콜레스테롤 1 ml (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
포집핀셋	다양한		예: Fisher Scientific #10300
37 °C 인큐베이터	다양한		아가 건조용
디지털 저울	다양한		플레이트 무게 및 아가 부피 결정용
구리 링	Plumbmaster	STK#35583 (48 캡 스레드 개스킷)	1.6 cm 내부 직경, 1.8 cm 외부 직경 구리 링
100% 에탄올	다양한
파라필름 M	Bemis	PM996
CCD 카메라	QImaging	RET-4000R-F-M-12	이 카메라는 큰 시야를 가지고 있습니다.
C-마운트 및 0.5X 렌즈가 있는 스테레오 현미경	Leica	MZ6	단종된 모델, M60이 현재 등가품입니다.
광원	Schott	A08923	시야 전체에 걸쳐 고르게 조명을 위한 3”x3”  백라이트
이미지 및 추적 소프트웨어	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	소프트웨어의 새 버전에는 추적 기능이 있습니다.