ייצור, אפיון ופוטנציאל שימושים של הוושט רירי דגם אדם מהונדס-רקמות 3D
Summary
כתב יד זה מתאר את הייצור, אפיון ושימושים פוטנציאליים של רקמת מבנה הוושט 3D מהונדס הוכנה מפיברובלסטים נורמלים עיקריים אנושיים הוושט ותאי אפיתל קשקש זורעים בתוך פיגום חזירי דה-cellularized. התוצאות מראות ההיווצרות של האפיתל מרובדת בוגר דומה לושט האדם הנורמלי.
Abstract
השכיחות של שתי אדנוקרצינומה של הוושט ומבשרה, מטפלזיה של בארט, עולה במהירות בעולם המערבי. יתר על כן אדנוקרצינומה של הוושט בדרך כלל יש פרוגנוזה גרועה, עם שיפור קטן בשיעורי הישרדות בשנים האחרונות. אלה הם תנאים קשים ללמוד ויש כבר חוסר פלטפורמות ניסוי מתאימים לחקור הפרעות של רירית הוושט.
מודל של רירית הוושט האנושית פותח במעבדה מקניל ש, בניגוד למערכות תרבית תאי 2D קונבנציונליות, משחזרת אינטראקציות תא-תא ותא-מטריצה הנוכחיות in vivo ומייצר האפיתל בוגר, מרובד דומה לזה של האדם הנורמלי וושט. בקצרה, המודל מנצל תאים נורמלים fibroblasts הוושט האנושי הראשוני ואפיתל-שינה לא גדלו בתוך פיגום הוושט acellular נגזר חזירי. אפיון immunohistochemical של מודל זהעל ידי CK4, CK14, Ki67 וinvolucrin צביעה מדגימה שחזור מתאים של היסטולוגיה של רירית הוושט אדם הנורמלית.
מודל זה מספק מודל חזק, רלוונטי מבחינה ביולוגית ניסיוני של רירית הוושט האנושית. זה יכול בקלות לטפל לחקור מספר שאלות מחקר כולל את האפקטיביות של סוכנים תרופתיים ואת ההשפעה של חשיפה לגורמים סביבתיים כגון אלכוהול, רעלים, טמפרטורה גבוהה או רכיבי refluxate גסטרו-הוושט. המודל מאפשר גם תקופות תרבות מורחבות לא השגה עם תרבות קונבנציונלית תא 2D, המאפשרת, בין היתר, המחקר על ההשפעה של חשיפה חוזרת ונשנית של האפיתל בוגר לסוכן של ריבית לעד 20 ימים. יתר על כן, מגוון רחב של שורות תאים, כגון אלה שמקורם בגידולים בושט או מטפלזיה של בארט, ניתן לשלב את המודל כדי לחקור תהליכים כגון פלישת גידול וresponsivene סמיםss ביותר מבחינה ביולוגית רלוונטי סביבה.
Introduction
רירית הוושט כוללת אפיתל מרובדת, קשקש מעל שכבה של רקמת חיבור, propria lamina, והוא אחד מהאתרים הראשונים שנתקלים בגורמי לחץ סביבתיים בליעה. חשיפה לרעלים תזונתיים מעורבת בפיתוח של קרצינומה של קשקש הוושט, תוך ריפלוקס duodenogastro-הוושט הוא גורם קריטי בפתוגנזה שלו של בארט מטפלזיה, אשר מזוהה עם עלייה בסיכון להתקדמות לאדנוקרצינומה של הוושט. קרצינומה של הוושט היא הגידול הממאיר הנפוץ ביותר -8 בגברים בבריטניה ואדנוקרצינומה של הוושט גדל במהירות בעולם המערבי 1. יתר על כן, חל שיפור קטן בתחזית מחלה, עם שיעור הישרדות של 5 שנים כוללת של כ -15%. כתוצאה מכך יש צורך בפלטפורמות ניסוי כדי לחקור את ההשפעה של חשיפה לגורמי לחץ סביבתי על אפיתל הוושט זה ומעורבותם האפשרית בdevelopment של מטפלזיה או גידולים.
למרות שורות תאים הונצחו או גידול לאפשר לחוקרים ללמוד את התגובה של תאי האפיתל ללחצים אלה במבחנה, הם נשארים שגשוג ולא מצליחים להתמיין אפיתל התאים הבוגרים שנמצאו בשכבות העליונות של רירית הוושט. יתר על כן, תאי קווים שכבר עברו tumorigenesis עשויים לספק מידע מוגבל בלבד לגבי התגובות הראשוניות של תאים נורמלים בתוך האפיתל לגורמים סביבתיים; וזה השלב שבו הפוטנציאל להתערבות טיפולית עשוי להיות הגבוה ביותר. לבסוף, מערכות תרבית תאים קונבנציונליות לא מצליחות ללכוד את האינטראקציות הפוטנציאליות חשובות בין תאי אפיתל mesenchymal ובין תאים אלה והמטריצה סביב המתרחשים בתוך רקמות in vivo.
מודלים של בעלי החיים לספק מייקרו-סביבה מציאותית יותר ללימוד התגובות של epitheli הוושטאממ ויכול לשלב האינדוקציה המלאכותית ריפלוקס גסטרו-הוושט 2. עם זאת זה יכול להיות מאתגר יותר כדי לתפעל את גורמי הלחץ הסביבתיים במודלים האלה והם לא יכולים לייצג את התגובה בתוך הוושט האנושי באופן מלא.
מודלים הוושט אחרים ניסיוניים אנושיים פותחו לנצל תאים ראשוניים, תאים הונצחו או שורות תאי גידול בקולגן, או בשילוב fibroblasts קולגן / Matrigel, פיגום המכיל 3,4. זה פחות עבודה אינטנסיבית כדי ליצור פיגומים אלה מפיגום הוושט acellular המתואר בכתב היד הזה, ומודלי organotypic אלה מספקים כלי שימושי, במיוחד במחקר של פלישת גידול 5,6, שבו תאי גידול חדירות לג'ל קולגן יכול להיות בקלות נצפה. עם זאת יש לי ג'ל קולגן אלה תכונות מכאניות שאינם ילידי הארץ וחסרי תכונות מסוימות של הרקמה המקורית, כולל קרום במרתף ספציפי וappropriatטופוגרפיה משטח דואר. זה יכול להשפיע על התנהגותם של תאים וכתוצאה מכך, לדוגמא, הדבקה עניות בין האפיתל והפיגום בעת שימוש בפיגום ג'ל קולגן 7. כתוצאה מכך פיגום הוושט חזירי acellular פותח, עם היתרון של להיות יותר מציאותי מבחינה ביולוגית פיגום ולכן יותר מתאים לשימוש כפלטפורמה ניסיונית. זה גם הוכח שעדיף לשלב תאים ראשוניים למבני הוושט מאשר קווים הנציחו הוושט אפיתל תאים, כגון Het-1A, מאז תאים אלה יוצרים אפיתל רב שכבתי, אבל לא מצליחים רבד או להבדיל 4,7,8 .
כתוצאה מכך, פרוטוקול זה הותאם משיטה כבר בשימוש במעבדה מקניל להכנת עור רקמות מהונדסים ורירית פה 9,10 ומשלב פיגום הוושט חזירי דה-cellularized בשילוב עם תאים ראשוניים אדם הוושט אפיתל fibroblasts. תיפרוטוקול של מייצר האפיתל בוגר, מרובדת, דומה לזו של וושט האדם הנורמלי כפי שהודגם על ידי CK4, CK14, Ki67 וinvolucrin מכתים. מודל התוצאה מספק פלטפורמה ניסיונית ללמוד תגובות ללחצים סביבתיים, ונעשה בו שימוש בצורה יעילה כדי לחקור שינויים בביטוי גנים באפיתל הוושט בתגובה לrefluxate רכיבים 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר את הייצור ואפיון של מודל ברירית הוושט רלוונטי מבחינה ביולוגית אנושי מתאים לשימוש כפלטפורמה ניסיונית ללמוד את ההשפעה של חשיפה לגורמי לחץ סביבתי על אפיתל הוושט.
השלבים הקריטיים ביותר לייצור המוצלח של מודל ברירית הו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למר רוג'ר אקרויד, מר אנדרו ויימן ומר כריס Stoddard, יועץ מנתחים בשפילד הוראת בתי החולים NHS Foundation Trust, לעזרתם ברכישת דגימות רקמת הוושט ותמיכתם של העבודה שלנו. אנו מודים Ashraful Haque על עזרתו בשילוב שורות תאי גידול למודל. הכרת תודה אנו מודים תמיכה כספית למחקר זה על ידי מענקים מBardhan המחקר והחינוך בנאמנות (ברנדה) וחקר סרטן יורקשייר (YCR).
Materials
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- . Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells – investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
