Produksjon, karakterisering og potensielle bruk av en 3D Tissue-konstruert Menneskelig Esophageal slimhinnene Model

Summary

Dette manuskriptet beskriver produksjon, karakterisering og potensielle anvendelser av en vev konstruert 3D esophageal konstruere forberedt fra normal primære humane esophageal fibroblast og squamous epitelceller seeded innenfor en de-cellularized svin stillaset. Resultatene viser dannelsen av et modent stratifisert epitel lik den normale humane spiserøret.

Abstract

Forekomsten av både esophageal adenokarsinom og dens forløper, Barretts Metaplasi, stiger raskt i den vestlige verden. Videre esophageal adenokarsinom har generelt en dårlig prognose, med liten forbedring i overlevelse de siste årene. Disse er vanskelige forhold for å studere og det har vært en mangel på egnede eksperimentelle plattformer for å undersøke sykdommer i spiserøret mucosa.

En modell av det menneskelige esophageal mucosa har blitt utviklet i laboratoriet MacNeil som, i motsetning til konvensjonell 2D-cellekultursystemer, sammenfatter de celle-celle og celle-matriks-vekselvirkninger er tilstede in vivo og gir et modent, stratifisert epitel lik som den normale humane spiserøret. I korthet benytter modell ikke-transform normale primære humane fibroblaster esophageal og epitelceller dyrket i et svine-avledet acellulær esophageal stillaset. Immunhistokjemisk karakterisering av denne modellenav CK4, CK14, Ki67 og involucrin farging demonstrerer riktig gjentagelse av histologi av den normale menneskelige esophageal slimhinner.

Denne modellen tilveiebringer en robust, biologisk relevant eksperimentell modell av det menneskelige esophageal mucosa. Det kan lett bli manipulert til å etterforske en rekke problemstillinger, inkludert effekten av farmakologiske midler og virkningen av eksponering for miljøfaktorer som alkohol, giftstoffer, høy gastro-esophageal refluksatet komponenter temperatur eller. Modellen forenkler også utvidede kultur perioder ikke oppnåelig med konvensjonelle 2D cellekultur, slik at blant annet studiet av effekten av gjentatt eksponering av en moden epitel til agent av interesse for opp til 20 dager. Videre er en rekke cellelinjer, slik som de som er avledet fra tumorer eller esophageal Barretts Metaplasi, kan bli innlemmet i en modell for å undersøke prosesser som tumorinvasjon og medikament responsiveness i en mer relevant biologisk miljø.

Introduction

Spiserør mucosa omfatter en lagdelt, plateepitel over et lag av bindevev, lamina propria, og er en av de første områder til å støte inntatte frie radikaler. Eksponering for diett toksiner er implisert i utviklingen av esophageal plateepitel carcinom, mens duodenogastro-esophageal reflux er en kritisk faktor i patogenesen av Barretts Metaplasi, som er forbundet med økt risiko for progresjon til esophageal adenokarsinom. Esophageal karsinomer er den ^8. vanligste ondartet svulst i britiske menn og esophageal adenokarsinom er raskt økende i den vestlige verden ^en. Videre har det vært liten bedring i sykdomsprognose, med en samlet 5-års overlevelse på rundt 15%. Følgelig er det et behov for eksperimentelle plattformer for å undersøke effekten av eksponering for miljømessige belastninger på denne esophageal epitel og deres potensielle engasjement i utvikledepment av metaplasia eller neoplasi.

Selv immortaliserte eller tumorcellelinjer tillater forskere å undersøke responsen til epitelceller i disse stressfaktorer in vitro, forblir de proliferative og unnlater å differensiere til modne epitelceller som finnes på de øverste lagene i esophageal mucosa. Videre kan cellelinjer som allerede har gjennomgått tumorigenesis gir bare begrenset informasjon om de innledende reaksjoner av normale celler i epitelet til miljøfaktorer; og dette er scenen når potensialet for terapeutisk intervensjon kan være høyest. Til slutt, konvensjonelle cellekultursystemer mislykkes i å fange opp potensielt viktige interaksjoner mellom epitelceller og mesenchymale celler, og mellom disse celler og den omgivende grunnmasse som oppstår i vev in vivo.

Dyremodeller gir et mer realistisk mikromiljøet for å studere svarene av esophageal epithelium og kan innlemme den kunstige induksjon av gastro-esophageal reflux sykdom ^2. Men det kan være mer utfordrende å manipulere miljømessige stressfaktorer i disse modellene, og de kan ikke fullt ut representerer svar innen den menneskelige spiserøret.

Andre eksperimentelle menneskelige esophageal modeller har blitt utviklet som utnytter primærceller, udødeliggjort celler eller tumorcellelinjer på en kollagen, eller kombinert kollagen / Matrigel, stillas inneholder fibroblaster ^3,4. Den er mindre arbeidskrevende å generere disse stillaser enn acellulær esophageal stillas som er beskrevet i dette manuskriptet, og disse organotypiske modellene gir et nyttig verktøy, spesielt i studiet av tumorinvasjon ^5,6, hvor tumorcelleinfiltrasjon inn i kollagen gel kan lett observert. Men disse kollagen gels har ikke-innfødte mekaniske egenskaper og mangler enkelte funksjoner i den opprinnelige vev, inkludert en bestemt basalmembran og appropriate overflatetopografi. Dette kan påvirke oppførselen av celler som resulterer i for eksempel dårligere adhesjon mellom epitel og stillaset ved bruk av en gel av kollagen stillas ^7. Som en konsekvens av dette acellulær porcint esophageal stillaset ble utviklet, med fordelen av å være et mer realistisk biologisk stillaset og således mer passende for bruk som en eksperimentell plattform. Det har også vist seg at det er bedre å innlemme primære celler i esophageal konstruksjonene enn udødeliggjorte esophageal epiteliale cellelinjer, for eksempel Het-1A, siden disse cellene danner en flerlags epitel, men unnlater å stratifisere eller differensiere ^4,7,8 .

Følgelig har denne protokollen er tilpasset fra en metode som allerede er i bruk i MacNeil laboratoriet for å gjøre vevet konstruert hud og slimhinner i munnen ^9,10 og har en de-cellularized porcin esophageal stillaset kombineres med primære humane esophageal epitelceller og fibroblaster. This protokollen produserer en moden, stratifisert epitel, lik som den normale humane spiserøret som demonstrert ved CK4, CK14, og Ki67 involucrin farging. Den resulterende modellen gir en eksperimentell plattform for å studere respons på miljøstressfaktorer, og har vært brukt effektivt til å undersøke endringer i genekspresjon i esophageal epitelet i respons til refluksatet komponenter ^11.

Protocol

Humane esophageal celler oppnås fra pasienter som gjennomgår kirurgi mage eller spiserør. Informert samtykke er innhentet for vev som skal brukes til forskningsformål, og vevet brukes anonymt under riktige etiske godkjenninger (SSREC 165/03, Human Forskning Tissue Bank Licence 12179). 1. Isolering av menneskelige Esophageal Epitelceller Å arbeide i en laminær strømningshette vevskultur og ved hjelp av steril teknikk, fremstille den epiteliale kulturmediet ved blanding av Dulbeccos modifiserte E…

Representative Results

Dette manuskriptet beskriver prosessen er nødvendig, er vist i skjematisk form på figur 1, til dyrknings 3D-modeller av human epitel esophageal med hell. For å bekrefte egnetheten av modellen som en eksperimentell plattform histologiske og immunhistokjemiske studier har blitt gjennomført sammenligne de dyrkede vev med normal menneskelig esophageal plateepitel slimhinnen. Histologisk vurdering av epitel fremstilt ved fremgangsmåten beskrevet viser en moden, flerlags, str…

Discussion

Dette manuskriptet beskriver fremstillingen og karakteriseringen av et biologisk relevant human esophageal slimhinnemodell egnet for bruk som en eksperimentell plattform for å studere effekten av eksponering for miljømessige belastninger på esophageal epitel.

De mest kritiske trinn for vellykket produksjon av en human esophageal slimhinne modellen: å sørge for at de fleste av de epiteliale celler forblir proliferativ og ikke allerede har begynt å skille før såing dem på stillaset; o…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)