إنتاج وتوصيف والمحتملة استخدامات الأنسجة المهندسة-3D الإنسان المريء المخاطي نموذج
Summary
تصف هذه المخطوطة إنتاج وتوصيف والاستخدامات المحتملة لالأنسجة المهندسة 3D بناء المريء المعدة من المريء الطبيعية الأولية الخلايا الليفية والخلايا البشرية الظهارية الحرشفية المصنفة ضمن سقالة دي cellularized الخنازير. أظهرت النتائج وتشكيل ظهارة طبقية ناضجة مماثلة إلى المريء الإنسان العادي.
Abstract
وقوع كل من غدية المريء والسلائف، حؤول باريت، ترتفع بسرعة في العالم الغربي. وعلاوة على ذلك غدية المريء عموما لديها سوء التشخيص، مع تحسن طفيف في معدلات البقاء على قيد الحياة في السنوات الأخيرة. هذه هي ظروف صعبة للدراسة، وكان هناك نقص في منصات التجريبية المناسبة لتحقيق اضطرابات في الغشاء المخاطي المريء.
وقد تم تطوير نموذج الغشاء المخاطي المريء البشري في المختبر ماكنيل الذي، على عكس الأنظمة خلية ثقافة 2D التقليدية، يلخص خلية خلية وخلية مصفوفة التفاعلات الموجودة في الجسم الحي وينتج ناضجة، ظهارة طبقية مماثلة لتلك التي للإنسان العادي المريء. لفترة وجيزة، ونموذج يستخدم خلايا غير طبيعية تحولت الخلايا الليفية المريء الإنسان الأساسية والظهارية نمت داخل ديكي سقالة المريء المشتقة من الخنازير. توصيف المناعى لهذا النموذجبواسطة CK4، CK14، Ki67 وinvolucrin تلطيخ يوضح خلاصة المناسب للأنسجة المخاطية المريء الإنسان العادي.
يوفر هذا النموذج نموذج قوي، بيولوجيا التجريبية من الغشاء المخاطي المريء البشري. يمكن بسهولة أن يتم التلاعب بها لتحقيق عدد من الأسئلة البحثية بما في ذلك فعالية كلاء الدوائية وتأثير التعرض للعوامل البيئية مثل الكحول والسموم، وارتفاع في درجة الحرارة أو مكونات refluxate المعدي المريئي. يسهل هذا النموذج أيضا فترات ممتدة الثقافة لا يمكن تحقيقها مع خلية ثقافة 2D التقليدية، مما يتيح، في جملة أمور، ودراسة تأثير التعرض المتكرر للظهارة ناضجة لوكيل لمصلحة لمدة تصل إلى 20 يوما. وعلاوة على ذلك، ومجموعة متنوعة من خطوط الخلايا، مثل تلك المستمدة من أورام المريء أو حؤول باريت، يمكن إدراجها في النموذج للتحقيق في عمليات مثل غزو الورم وresponsivene المخدراتSS في بيئة أكثر ملاءمة من الناحية البيولوجية.
Introduction
ويتكون الغشاء المخاطي المريء والطبقية، ظهارة الحرشفية فوق طبقة من النسيج الضام، الصفيحة المخصوصة، ويعد واحدا من المواقع الأولى لمواجهة الضغوطات البيئية بلعها. هو متورط التعرض للسموم الغذائية في تطور سرطان المريء الحرشفية، بينما-duodenogastro المريء الجزر هو العامل الحاسم في التسبب في حؤول باريت، الذي يرتبط مع زيادة خطر تطور الى غدية المريء. سرطان المريء هي الورم الخبيث الأكثر شيوعا ال 8 في الذكور UK وغدية المريء يتزايد بسرعة في العالم الغربي 1. وعلاوة على ذلك، كان هناك تحسن طفيف في تشخيص المرض، مع معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات الإجمالي حوالي 15٪. ونتيجة لذلك هناك حاجة لمنصات التجريبية للتحقيق في تأثير التعرض للضغوطات البيئية على هذا ظهارة المريء ومشاركتها المحتملة في development من حؤول أو الأورام.
على الرغم من خطوط الخلايا خلد أو ورم تسمح للباحثين لدراسة استجابة الخلايا الظهارية لهذه الضغوطات في المختبر، إلا أنها تظل التكاثري وتفشل في التمايز إلى خلايا الظهارية ناضجة وجدت على الطبقات العليا من الغشاء المخاطي المريء. وعلاوة على ذلك، وخطوط الخلايا التي خضعت بالفعل تكون الأورام قد توفر معلومات محدودة فقط بشأن الاستجابات الأولية من الخلايا الطبيعية داخل الظهارة إلى العوامل البيئية؛ وهذه هي المرحلة عندما إمكانية التدخل العلاجي قد تكون أعلى. أخيرا، تفشل نظم زراعة الخلايا التقليدية للقبض على التفاعلات المهمة المحتملة بين الخلايا الظهارية والوسيطة وبين هذه الخلايا والمصفوفة المحيطة التي تحدث داخل أنسجة في الجسم الحي.
النماذج الحيوانية توفر المكروية أكثر واقعية لدراسة ردود epitheli المريءأم ويمكن أن تتضمن تحريض الاصطناعي لل-مرض الجزر المعدي المريئي (2). لكن يمكن أن يكون أكثر تحديا لمعالجة الضغوطات البيئية في هذه النماذج وأنها قد لا تمثل تماما على رد في غضون المريء البشري.
وقد وضعت نماذج تجريبية المريء الإنسان الأخرى التي تستخدم الخلايا الأولية، وخلايا خلدت أو خطوط الخلايا السرطانية على الكولاجين، أو الجمع بين الكولاجين / Matrigel، سقالة التي تحتوي على الخلايا الليفية 3،4. أنها أقل كثافة عمالية لتوليد هذه الاطر من سقالة المريء ديكي وصفها في هذه المخطوطة، وهذه النماذج عضوي النمط توفر أداة مفيدة، ولا سيما في دراسة غزو الورم 5،6، حيث تسلل الخلايا السرطانية في هلام الكولاجين يمكن أن يكون بسهولة لوحظ. ولكن هذه المواد الهلامية الكولاجين لها خصائص ميكانيكية غير الأصلية وتفتقر إلى ميزات معينة من الأنسجة الأصلية، بما في ذلك الغشاء القاعدي محددة وappropriatالبريد تضاريس السطح. هذا يمكن أن تؤثر على سلوك الخلايا الناتجة، على سبيل المثال، التصاق فقرا بين الظهارة وسقالة عند استخدام الكولاجين هلام سقالة 7. ونتيجة لذلك تم تطوير سقالة المريء الخنازير ديكي، مع ميزة كونها سقالة أكثر واقعية من الناحية البيولوجية، وبالتالي أكثر ملاءمة للاستخدام كمنصة التجريبية. وقد تبين أيضا أنه من الأفضل أن دمج الخلايا الأولية في بنيات المريء من خطوط الخلايا الظهارية خلد المريء، مثل هيت-1A، لأن هذه الخلايا تشكل ظهارة متعددة الطبقات لكنه يفشل في تطبق أو تمييز 4،7،8 .
ونتيجة لذلك، تم تكييف هذا البروتوكول من طريقة مستخدمة بالفعل في المختبر ماكنيل لصنع الأنسجة المهندسة الجلد والغشاء المخاطي للفم 9،10 ويشتمل على الخنازير سقالة دي cellularized المريء جنبا إلى جنب مع خلايا المريء الإنسان الأساسية الظهارية والخلايا الليفية. ثيالصورة بروتوكول ينتج ناضجة، ظهارة طبقية، مماثلة لتلك التي من المريء الإنسان العادي كما يتبين من CK4، CK14، Ki67 وinvolucrin تلطيخ. يوفر النموذج الناتج منصة تجريبية لدراسة الردود على الضغوطات البيئية، واستخدمت على نحو فعال لتحقيق تغييرات في التعبير الجيني في الظهارة المريء ردا على refluxate مكونات 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه المخطوطة إنتاج وتوصيف المريء البشري نموذج الغشاء المخاطي بيولوجيا مناسبة لاستخدامها بوصفها منصة تجريبية لدراسة تأثير التعرض للالضغوطات البيئية على ظهارة المريء.
الخطوات الأكثر أهمية لإنتاج الناجح لنموذج الغشاء المخاط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون للسيد روجر أكرويد، السيد أندرو وايمان والسيد كريس ستودارد، مستشار الجراحون في شيفيلد المستشفيات التعليمية NHS مؤسسة ترست، لمساعدتهم في الحصول على عينات الأنسجة المريء ودعمهم لعملنا. نشكر أشرف انعام الحق لمساعدته دمج خطوط الخلايا السرطانية في النموذج. نحن نعترف بامتنان الدعم المالي لهذه الدراسة من المنح المقدمة من باردهان البحوث والتعليم الثقة (BRET) ويوركشاير أبحاث السرطان (YCR).
Materials
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- . Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells – investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
