Productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een 3D Tissue-engineered Human Slokdarmkanker Mucosale Model

Summary

Dit manuscript beschrijft de productie, karakterisering en toepassingsmogelijkheden van een tissue engineered 3D-oesofageale construct bereid uit normale primaire menselijke slokdarm fibroblast en squameuze epitheelcellen gezaaid binnen een de-cellularized varkens schavot. De resultaten tonen de vorming van een volwassen gelaagd epitheel gelijk aan de normale menselijke esophagus.

Abstract

De incidentie van zowel esophageal adenocarcinoom en haar voorloper, Barrett's Metaplasie, snel stijgen in de westerse wereld. Verder esophageal adenocarcinoom in het algemeen een slechte prognose, met weinig verbetering in overleving afgelopen jaren. Dit zijn moeilijke omstandigheden te bestuderen en er is een gebrek aan geschikte experimentele platformen om aandoeningen van de slokdarm slijmvlies onderzoeken geweest.

Een model van de menselijke slokdarm slijmvlies is in de MacNeil laboratorium dat, in tegenstelling tot conventionele 2D celkweek systemen, recapituleert de cel-cel en cel-matrix interacties die in vivo en produceert een volwassen gestratificeerde epitheel vergelijkbaar met die van de normale menselijke ontwikkeling slokdarm. In het kort, het model maakt gebruik van niet-getransformeerde normale primaire menselijke esophagus fibroblasten en epitheelcellen gekweekt bij een-varken afgeleide acellulaire esophageal scaffold. Immunohistochemische karakterisering van dit modeldoor CK4, CK14, Ki67 en involucrine vlekken toont juiste herhaling van de histologie van het normale menselijke slokdarm slijmvlies.

Dit model verschaft een robuuste, biologisch relevant testmodel van het menselijke oesofageale slijmvlies. Het kan gemakkelijk worden gemanipuleerd om een ​​aantal research vragen waarbij de effectiviteit van farmacologische middelen en het effect van blootstelling aan milieufactoren zoals alcohol, toxinen, hoge temperatuur of gastro-oesofageale refluxaat componenten onderzoeken. Het model maakt ook langere kweek niet worden bereikt met conventionele 2D celkweek, waardoor onder meer de studie van de effecten van herhaalde blootstelling van een volwassen epitheel aan het agens van belang tot 20 dagen. Verder zijn diverse cellijnen, zoals die afgeleid van oesofageale tumoren of Barrett's metaplasie kan worden in het model opgenomen processen als tumorinvasie en drugs responsivene onderzoekenss in een biologisch relevante omgeving.

Introduction

Het oesofageale slijmvlies omvat een gelaagd, plaveiselepitheel boven een laag van bindweefsel, de lamina propria, en is één van de eerste locaties aan geconsumeerde milieustressoren tegenkomen. Blootstelling aan voedingstoxines is betrokken bij het ontstaan ​​van slokdarmkanker squameus carcinoom, terwijl duodenogastro-oesofageale reflux is een kritische factor in de pathogenese van Barrett's metaplasie die is geassocieerd met een verhoogd risico om esophageal adenocarcinoom. Oesofageale carcinomen zijn de ^8e meest voorkomende kwaadaardige tumor in het Verenigd Koninkrijk mannen en slokdarmkanker adenocarcinoom neemt snel toe in de westerse wereld ^1. Verder is er weinig verbetering in ziekteprognose, met een totale 5-jaars overlevingspercentage van ongeveer 15% geweest. Er is daarom behoefte experimenteerplatforms het effect van blootstelling aan milieustressoren deze esophagus epithelium en hun mogelijke betrokkenheid bij de ontwikke onderzoekenpment van metaplasia of neoplasie.

Hoewel geïmmortaliseerde of tumorcellijnen kunnen onderzoekers om de respons van epitheelcellen deze stressoren in vitro bestuderen, blijven ze proliferatieve en niet te differentiëren in de rijpe epitheelcellen op de bovenste lagen van de oesofageale slijmvlies. Voorts kunnen cellijnen die al tumorigenese hebben ondergaan slechts beperkte informatie over de eerste reacties van normale cellen in het epitheel milieufactoren verschaffen; en dit is de fase waarin de mogelijkheden voor therapeutische interventie hoogst kunnen zijn. Tenslotte conventionele celkweek systemen niet de potentieel belangrijke interacties tussen epitheliale en mesenchymale cellen en tussen cellen en de omringende matrix die binnen de weefsels in vivo te vangen.

Diermodellen een meer realistische micro-omgeving voor het bestuderen van de reacties van de slokdarm epithelium en kan de kunstmatige inductie van gastro-oesofageale refluxziekte ² op te nemen. Het kan echter een grotere uitdaging om de milieu stressoren in deze modellen te manipuleren zijn en ze kunnen niet volledig de reactie binnen het menselijke slokdarm vertegenwoordigen.

Andere experimentele menselijke esophagus modellen ontwikkeld dat primaire cellen, geïmmortaliseerde cellen of tumorcellijnen gebruik op een collageen of gecombineerde collageen / Matrigel, scaffold met fibroblasten ^3,4. Het is minder arbeidsintensief deze scaffolds dan acellulaire esophageal scaffold in dit manuscript beschreven genereren en deze organotypische modellen verschaffen een nuttig hulpmiddel, met name in de studie van tumorinvasie ^5,6, waarbij tumorcelinfiltratie in de collageengel gemakkelijk kan worden waargenomen. Maar deze collageen gels hebben niet-inheemse mechanische eigenschappen en gebrek aan bepaalde kenmerken van het oorspronkelijke weefsel, met inbegrip van een specifiek basaal membraan en de appropriate oppervlaktetopografie. Dit kan het gedrag van cellen resulterend in beïnvloeden, bijvoorbeeld slechtere hechting tussen epitheel en scaffold bij gebruik van een collageengel scaffold ^7. Bijgevolg zijn de acellulaire varkens esophageal scaffold ontwikkeld met het voordeel dat een biologisch realistische scaffold en dus meer geschikt voor gebruik als experimenteel platform. Ook is gebleken dat het beter is om primaire cellen nemen in de esophagus constructen dan geïmmortaliseerde slokdarm epitheliale cellijnen zoals Het-1A, aangezien deze cellen vormen een gelaagd epitheel maar niet om stratificeren en differentiëren ^4,7,8 .

Bijgevolg is dit protocol werd aangepast van een methode die al in gebruik in de MacNeil laboratorium voor het maken van tissue engineered huid en het mondslijmvlies ^9,10 en bevat een de-cellularized varkens slokdarm steiger in combinatie met primaire menselijke slokdarm epitheliale cellen en fibroblasten. This protocol vormt een volwassen gestratificeerde epitheel, vergelijkbaar met die van de normale menselijke esophagus zoals blijkt uit CK4, CK14, Ki67 en involucrine kleuring. Het resulterende model biedt een experimenteel platform voor reacties op milieustressoren studeren, en daadwerkelijk is gebruikt om veranderingen in genexpressie te onderzoeken in de slokdarm epitheel in reactie op de onderdelen ¹¹ refluxaat.

Protocol

Menselijke slokdarm cellen worden verkregen van patiënten die maag of slokdarm operatie. Geïnformeerde toestemming is verkregen voor het weefsel te worden gebruikt voor onderzoeksdoeleinden, en het weefsel anoniem gebruikt onder de juiste ethische goedkeuringen (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179). 1. Isolatie van de Mens Slokdarmkanker epitheelcellen Werken in een laminaire stroming weefselkweek kap en met steriele techniek bereidt de epitheliale kweekmedium door menging Dulbecc…

Representative Results

Dit manuscript beschrijft het proces benodigde getoond in schematische vorm in figuur 1, de cultuur 3D-modellen van de menselijke esophagus epithelium succes. Om de geschiktheid van het model te bevestigen als experimenteel platform histologische en immunohistochemische studies uitgevoerd vergelijken van de gekweekte normale humane weefsels esophageal squameuze slijmvlies. Histologische evaluatie van het epitheel door de beschreven werkwijze wordt een volwassen, multi-layere…

Discussion

Dit manuscript beschrijft de productie en karakterisering van een biologisch relevante menselijke esophagus mucosale model geschikt voor gebruik als een experimenteel platform om het effect van blootstelling aan milieustressoren op de esophagus epithelium bestuderen.

De belangrijkste stappen voor de succesvolle productie van een humaan oesofageale slijmvlies model zijn: ervoor zorgen dat de meeste epitheelcellen proliferatieve blijven zitten en nog niet begonnen te differentiëren voordat ze…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)