Production, la caractérisation et utilisations potentielles d'un humain de l'oesophage muqueux modèle 3D de l'ingénierie tissulaire

Summary

Ce manuscrit décrit la production, la caractérisation et les utilisations potentielles d'une ingénierie tissulaire de construction de l'œsophage 3D préparé à partir de fibroblastes humains primaires normale de l'œsophage et les cellules épithéliales squameuses ensemencées dans un échafaudage porcine de-cellularisée. Les résultats mettent en évidence la formation d'un épithélium stratifié mûr similaire à l'oesophage humain normal.

Abstract

L'incidence à la fois de l'adénocarcinome oesophagien et son précurseur, métaplasie de Barrett, augmentent rapidement dans le monde occidental. En outre adénocarcinome oesophagien a généralement un mauvais pronostic, avec peu d'amélioration dans les taux de survie au cours des dernières années. Ces conditions sont difficiles à étudier et il ya eu un manque de plates-formes expérimentales appropriées pour enquêter sur les troubles de la muqueuse œsophagienne.

Un modèle de la muqueuse de l'oesophage humain a été développé dans le laboratoire MacNeil qui, à la différence des systèmes de culture de cellules 2D conventionnelles, récapitule les interactions cellule-cellule et cellule-matrice présents in vivo et produit un mature, épithélium stratifié semblable à celui de l'être humain normal œsophage. En résumé, le modèle utilise des cellules non transformées normales de fibroblastes primaires humains de l'œsophage et epitheliales cultivées dans un échafaud oesophagien acellulaire dérivée de porc. La caractérisation immunohistochimique de ce modèlepar CK4, CK14, Ki67 et involucrine coloration montre récapitulation approprié de l'histologie de la muqueuse de l'œsophage humain normal.

Ce modèle fournit un robuste modèle expérimental, biologiquement pertinente de la muqueuse œsophagienne humaine. Il peut facilement être manipulée pour enquêter sur un certain nombre de questions de recherche, y compris l'efficacité des agents pharmacologiques et l'impact de l'exposition à des facteurs environnementaux tels que l'alcool, les toxines, à haute température ou des composants de produit de reflux gastro-oesophagien. Le modèle facilite également les périodes de culture prolongées pas réalisables avec la culture cellulaire classique en 2D, permettant, entre autres, l'étude de l'impact de l'exposition répétée d'un épithélium mature pour l'agent d'intérêt pour un maximum de 20 jours. En outre, une variété de lignées cellulaires, telles que celles dérivées de tumeurs de l'oesophage ou métaplasie de Barrett, peut être incorporé dans le modèle pour étudier des processus tels que l'invasion tumorale et le médicament responsiveness dans un environnement plus biologiquement pertinente.

Introduction

La muqueuse de l'œsophage comprend, un épithélium malpighien-dessus d'une couche de tissu conjonctif, la lamina propria, et est l'un des premiers sites à rencontrer facteurs de stress environnementaux ingérés. L'exposition à des toxines alimentaires est impliqué dans le développement du carcinome épidermoïde de l'oesophage, tandis que duodenogastro-oesophagien reflux est un facteur critique dans la pathogenèse de la métaplasie de Barrett, qui est associé à un risque accru de progression de l'adénocarcinome de l'oesophage. Cancer de l'œsophage sont la 8 ^ème tumeur maligne la plus fréquente chez les hommes au Royaume-Uni et l'adénocarcinome oesophagien augmente rapidement dans le monde occidental ^1. En outre, il ya eu peu d'amélioration dans le pronostic de la maladie, avec un taux de survie globale à 5 ans de l'ordre de 15%. Par conséquent, il existe un besoin pour des plates-formes expérimentales pour étudier l'impact de l'exposition aux facteurs de stress environnementaux sur cette épithélium oesophagien et leur implication potentielle dans le développement de la métaplasie ou néoplasie.

Bien que des lignées cellulaires immortalisées ou tumorales permettent aux chercheurs d'étudier la réponse des cellules épithéliales à ces facteurs de stress in vitro, ils restent proliferative et ne parviennent pas à se différencier en cellules épithéliales matures présents sur les couches supérieures de la muqueuse de l'oesophage. En outre, les lignées cellulaires qui ont déjà subi la tumorigenèse peuvent fournir que des informations limitées concernant les réponses initiales de cellules normales dans l'épithélium à des facteurs environnementaux; et ceci est l'étape où le potentiel pour une intervention thérapeutique peut être plus élevé. Enfin, les systèmes de culture cellulaire classiques ne parviennent pas à saisir les interactions potentiellement importantes entre les cellules epitheliales et mésenchymateuses et entre ces cellules et la matrice environnante qui se produisent dans les tissus in vivo.

Des modèles animaux fournissent un micro-environnement plus réaliste pour l'étude des réponses des epitheli oesophagienum et peut incorporer l'induction artificielle de reflux gastro-oesophagien maladie ^2. Toutefois, il peut être plus difficile à manipuler les facteurs de stress environnementaux dans ces modèles et ils ne peuvent pas représenter pleinement la réponse dans l'œsophage humain.

D'autres modèles expérimentaux œsophagienne humains ont été développés qui utilisent des cellules primaires, des cellules immortalisées ou des lignées de cellules tumorales sur un collagène, le collagène ou combiné / Matrigel, échafaud contenant des fibroblastes ^3,4. Il est moins de travail pour générer ces échafaudages que l'échafaud de l'œsophage acellulaire décrit dans ce manuscrit, et ces modèles organotypiques fournir un outil utile, en particulier dans l'étude de l'invasion tumorale ^5,6, où l'infiltration des cellules tumorales dans le gel du collagène peut être facilement observée. Toutefois, ces gels de collagène ont des propriétés mécaniques non-indigènes et manquent certaines caractéristiques du tissu d'origine, y compris une membrane basale spécifique et le appropriate topographie de la surface. Cela peut influencer le comportement des cellules résultant, par exemple, l'adhésion plus pauvres entre l'épithélium et échafaudage lors de l'utilisation d'un échafaudage de collagène gel ^7. En conséquence, l'échafaudage de l'œsophage porcine acellulaire a été développé, avec l'avantage d'être un échafaudage biologiquement plus réaliste et donc plus appropriée pour une utilisation comme une plate-forme expérimentale. Il a également été montré qu'il est préférable d'incorporer des cellules primaires dans les produits d'assemblage de l'œsophage que des lignées cellulaires immortalisées épithéliales de l'œsophage, tels que Het-1A, étant donné que ces cellules forment un épithélium multicouches mais ne parviennent pas à stratifier ou ^4,7,8 différencier .

Par conséquent, ce protocole a été adapté à partir d'une méthode déjà utilisée dans le laboratoire pour la fabrication de tissus MacNeil peau ingénierie et la muqueuse buccale ^9,10 et intègre un échafaudage oesophagien porcine de-cellularisée combinée avec des cellules humaines oesophagiennes épithéliales et les fibroblastes primaires. This protocole produit, un épithélium stratifié mature, similaire à celle de l'oesophage humain normal comme démontré par CK4, CK14, Ki67 et involucrine coloration. Le modèle qui en résulte fournit une plate-forme expérimentale pour étudier les réponses aux facteurs de stress environnementaux, et a été utilisé efficacement pour étudier les changements dans l'expression des gènes dans l'épithélium de l'œsophage en réponse à reflué composants ^11.

Protocol

Cellules de l'œsophage de l'homme sont obtenus chez des patients subissant une chirurgie gastrique ou oesophagien. Le consentement éclairé est obtenu pour le tissu à être utilisé à des fins de recherche, et le tissu utilisé de manière anonyme sous les approbations éthiques appropriées (SSREC 165/03, la banque de tissus humains à la recherche de licence 12179). 1. Isolement des cellules épithéliales humaines de l'oesophage Travailler dans un écoulement laminaire hotte de cult…

Representative Results

Ce manuscrit décrit le processus requis, indiqué sous forme schématique à la figure 1, à la culture des modèles 3D de l'épithélium oesophagien humaine succès. Pour confirmer la pertinence du modèle en tant que plate-forme histologique expérimental et des études immunohistochimiques ont été réalisées en comparant les tissus cultivés avec muqueuse épidermoïde de l'oesophage humain normal. Évaluation histologique de l'épithélium produite par le…

Discussion

Ce manuscrit décrit la production et la caractérisation d'un modèle de la muqueuse oesophagienne humaine biologiquement pertinente peut être utilisé comme une plate-forme expérimentale pour étudier l'impact de l'exposition aux facteurs de stress environnementaux sur l'épithélium de l'œsophage.

Les étapes les plus critiques pour la production réussie d'un modèle de la muqueuse de l'œsophage humain sont: veiller à ce que la majorité des cellules épi…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)