Herstellung, Charakterisierung und Einsatzmöglichkeiten von 3D-Tissue-Engineering Menschen Ösophagus-Schleimhaut-Modell

Summary

Diese Handschrift beschreibt die Herstellung, Charakterisierung und Anwendungsmöglichkeiten eines mittels Tissue Engineering 3D-Ösophagus-Konstrukt von normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Plattenepithelzellen in einem de-cellularized Schweine Gerüst ausgesät vorbereitet. Die Ergebnisse zeigen die Bildung eines reifen geschichteten Epithel ähnlich dem normalen menschlichen Speiseröhre.

Abstract

Die Inzidenz von beiden Adenokarzinom des Ösophagus und seine Vorläufer, Barrett-Metaplasie, steigen schnell in der westlichen Welt. Darüber Adenokarzinom des Ösophagus hat in der Regel eine schlechte Prognose, mit wenig Verbesserung der Überlebensraten in den letzten Jahren. Dies sind schwierigen Bedingungen zu untersuchen, und es wurde ein Mangel an geeigneten Versuchsplattformen Störungen der Schleimhaut der Speiseröhre zu untersuchen.

Ein Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre in der MacNeil Labor, welches im Gegensatz zu herkömmlichen 2D-Zellkultursystemen, fasst die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Wechselwirkungen in vivo vorhanden ist und erzeugt ein reifes, geschichteten Epithel ähnlich der der normalen menschlichen entwickelt Ösophagus. Kurz gesagt, verwendet das Modell nicht transformierten normalen primären humanen Ösophagus-Fibroblasten und Epithelzellen innerhalb eines Schweine-abgeleiteten acellular Ösophagus-Gerüst gezüchtet. Immunhistochemische Charakterisierung dieses Modellvon CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung zeigt entsprechende Wiederholung der Histologie des normalen menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre.

Dieses Modell bietet eine robuste, biologisch relevanten experimentellen Modell der menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre. Es kann leicht verändert werden, um eine Reihe von Forschungsfragen auch auf die Wirksamkeit von pharmakologischen Mitteln und die Auswirkungen der Einwirkung von Umweltfaktoren wie beispielsweise Alkohol, Toxine, hoher Temperatur oder gastroösophagealen refluxate Komponenten zu untersuchen. Das Modell erleichtert auch mit herkömmlichen 2D-Zellkultur, so dass unter anderem erreichbare erweiterte Kulturperioden, die Studie über die Auswirkungen einer wiederholten Exposition eines reifen Epithel an den Agenten von Interesse für die bis zu 20 Tage. Ferner ist eine Vielzahl von Zelllinien, wie die von Speiseröhrentumoren oder Barrett-Metaplasie abgeleitet können in das Modell eingearbeitet, um Prozesse wie Tumorinvasion und Drogen responsivene untersuchenss in einer biologisch relevanten Umfeld.

Introduction

Die Schleimhaut der Speiseröhre besteht aus einem geschichteten, Plattenepithel über einer Schicht von Bindegewebe, der Lamina propria, und ist eine der ersten Websites, um aufgenommen belastenden Umweltfaktoren zu begegnen. Die Exposition gegenüber Nahrungsgifte ist in der Entwicklung von Ösophagus-Plattenepithel-Karzinom in Verbindung gebracht, während duodenogastro-Reflux ist ein kritischer Faktor in der Pathogenese von Barrett-Metaplasie, die mit einem erhöhten Risiko der Progression zu einem Adenokarzinom der Speiseröhre verbunden ist. Ösophagus-Karzinome sind die häufigste bösartige Tumor ^8. in UK Männchen und Adenokarzinom des Ösophagus ist schnell in der westlichen Welt ¹ erhöht. Weiterhin hat es eine geringe Verbesserung der Krankheitsprognose mit einer 5-Jahres-Überlebensrate von etwa 15%. Folglich gibt es einen Bedarf für experimentelle Plattformen um die Auswirkungen der Exposition gegenüber Umweltbelastungen in diesem ösophagealem Epithel und deren mögliche Beteiligung an der develo untersuchenpment der Metaplasie oder Neoplasien.

Obwohl immortalisierte oder Tumorzelllinien können die Forscher die Reaktion der Epithelzellen auf diese Stressfaktoren in vitro zu studieren, bleiben sie proliferative und scheitern in den reifen Epithelzellen auf den obersten Schichten der Schleimhaut der Speiseröhre gefunden zu unterscheiden. Ferner kann Zellinien, die bereits unterzogen worden sind Tumorigenese nur begrenzte Informationen über die ursprünglichen Antworten von normalen Zellen im Epithel von Umweltfaktoren zu liefern; und dies ist die Phase, wenn das Potential für die therapeutische Intervention kann höchsten sind. Schließlich herkömmlichen Zellkultursystemen nicht den potentiell wichtigen Wechselwirkungen zwischen epithelialen und mesenchymalen Zellen und zwischen diesen Zellen und der umgebenden Matrix, die in Geweben in vivo auftreten, zu erfassen.

Tiermodelle bieten ein realistischeres Mikroumgebung für die Untersuchung der Reaktionen des Ösophagus epithelium und kann die künstliche Induktion von Magen-Reflux-Krankheit ² zu integrieren. Allerdings kann es schwieriger, um die belastenden Umweltfaktoren in diesen Modellen zu manipulieren und sie können nicht vollständig repräsentativ ist die Reaktion innerhalb des menschlichen Speiseröhre.

Andere experimentelle menschlichen Ösophagus Modelle entwickelt worden, die Primärzellen, immortalisierte Zellen oder Tumorzelllinien auf einem Kollagen zu verwenden, oder in Kombination Collagen / Matrigel, Gerüst Fibroblasten enthaltende ^3,4. Es ist weniger arbeitsaufwendig, diese Gerüste als die in diesem Manuskript beschrieben azellulären Speiseröhren Gerüst zu erzeugen und diese organotypischen Modelle ein nützliches Mittel, insbesondere bei der Untersuchung von Tumorinvasion ^5,6, bei Tumorzellinfiltration in das Kollagengel kann leicht sein, beobachtet. Aber diese Kollagen-Gele besitzen nicht-native mechanischen Eigenschaften und fehlen bestimmte Eigenschaften des ursprünglichen Gewebes, einschließlich einer spezifischen Basalmembran und der appropriate Oberflächentopographie. Dies kann das Verhalten der Zellen, was zu beeinflussen, beispielsweise, eine schlechtere Haftung zwischen dem Epithel und Gerüst bei Verwendung eines Kollagengels Gerüst ^7. Als Folge der azellulären Schweinespeiseröhren Gerüst entwickelt, mit dem Vorteil, dass eine biologisch-realistische Gerüst und zur Verwendung als experimentelle Plattform somit besser geeignet. Es wurde auch gezeigt, dass es besser ist, Primärzellen in die Speiseröhre Konstrukte als immortalisierte Speiseröhre epithelialen Zellinien, wie Het-1A integrieren, da diese Zellen bilden einen mehrschichtigen Epithels aber nicht zu schichten oder zu differenzieren ^4,7,8 .

Daher hat dieses Protokoll von einer Methode bereits in der MacNeil Labor zur Herstellung von Tissue Engineering Haut und Mundschleimhaut ^9,10 angepasst worden und verfügt über eine de-cellularized Schweine Ösophagus-Gerüst verbunden mit primären humanen Ösophagus-Epithelzellen und Fibroblasten. This Protokoll erzeugt eine ausgereifte, geschichteten Epithel, ähnlich zu derjenigen des normalen menschlichen Speiseröhre durch CK4, CK14, Ki67 und Involucrin Färbung nachgewiesen. Das resultierende Modell stellt eine experimentelle Plattform um Reaktionen auf Umweltstressfaktoren zu untersuchen, und wurde effektiv in Reaktion auf die Veränderung der Genexpression in Ösophagusepithel untersuchen, um Bauteile ¹¹ refluxate.

Protocol

Menschlichen Ösophagus-Zellen von Patienten, die eine Magen-oder Speiseröhrenkrebs Chirurgie erhalten. Informierte Zustimmung erhalten wird für das Gewebe für Forschungszwecke verwendet werden, und das Gewebe anonym unter den entsprechenden ethischen Genehmigungen (SSREC 165/03, Human Research Tissue Bank Licence 12179) verwendet. 1. Isolierung von menschlichen Ösophagus-Epithelzellen Arbeiten in einer laminaren Strömung Gewebekulturhaube und mit einer sterilen Technik bereiten die epithelialen …

Representative Results

Diese Handschrift beschreibt den Prozess erforderlich ist, in schematischer Form in 1 dargestellt ist, die Kultur von 3D-Modellen des menschlichen Ösophagusepithel erfolgreich. Um die Eignung des Modells bestätigen, als Experimentierplattform histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen wurden unternommen, den Vergleich der kultivierten Geweben mit normalen menschlichen Ösophagus-Schleimhaut. Histologische Beurteilung der nach dem beschriebenen Verfahren hergest…

Discussion

Diese Handschrift beschreibt die Herstellung und Charakterisierung einer biologisch relevanten menschlichen Ösophagus-Schleimhaut-Modell geeignet für den Einsatz als experimentelle Plattform, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber belastenden Umweltfaktoren auf die Ösophagusepithel studieren.

Die wichtigsten Schritte für die erfolgreiche Produktion eines menschlichen Schleimhaut der Speiseröhre Modells sind: Sicherstellung, dass die Mehrheit der Epithelzellen bleibt proliferative…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)