एक 3 डी ऊतक इंजीनियर मानव इसोफेजियल mucosal मॉडल का उत्पादन, लक्षण और क्षमता का उपयोग करता
Summary
इस पांडुलिपि उत्पादन, लक्षण और सामान्य प्राथमिक मानव esophageal तंतुप्रसू और एक de-cellularized सुअर का पाड़ के भीतर वरीयता प्राप्त स्क्वैमस उपकला कोशिकाओं से तैयार एक ऊतक इंजीनियर 3 डी esophageal निर्माण की क्षमता का उपयोग करता वर्णन करता है। परिणाम सामान्य मानव घेघा करने के लिए इसी तरह की एक परिपक्व स्तरीकृत उपकला के गठन प्रदर्शित करता है।
Abstract
esophageal ग्रंथिकर्कटता और उसके अग्रदूत, बैरेट इतरविकसन दोनों की घटनाओं, पश्चिमी दुनिया में तेजी से बढ़ रहे हैं। इसके अलावा esophageal ग्रंथिकर्कटता आम तौर पर हाल के वर्षों में जीवित रहने की दरों में थोड़ा सुधार के साथ एक गरीब रोग का निदान है। ये अध्ययन करने के लिए कठिन परिस्थितियों कर रहे हैं और esophageal म्यूकोसा के विकारों की जांच के लिए उपयुक्त प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों की कमी हुई है।
मानव esophageal म्यूकोसा की एक मॉडल पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृति प्रणालियों के विपरीत, विवो में मौजूद सेल सेल और सेल-मैट्रिक्स बातचीत का स्मरण दिलाता है और सामान्य मानव के समान एक परिपक्व, स्तरीकृत उपकला पैदा करता है, जो मेकनेल प्रयोगशाला में विकसित किया गया है घेघा। संक्षेप में, मॉडल एक सुअर का व्युत्पन्न अकोशिकीय esophageal पाड़ के भीतर हो गैर तब्दील प्राथमिक मानव esophageal fibroblasts के सामान्य और उपकला कोशिकाओं का इस्तेमाल करता है। इस मॉडल के immunohistochemical लक्षण वर्णनCK4, CK14, Ki67 द्वारा और involucrin धुंधला सामान्य मानव esophageal mucosa के ऊतक विज्ञान की उचित आवृत्ति को दर्शाता है।
इस मॉडल को मानव esophageal म्यूकोसा के एक मजबूत, जैविक रूप से प्रासंगिक प्रयोगात्मक मॉडल प्रदान करता है। यह आसानी से औषधीय एजेंटों की प्रभावशीलता और ऐसी शराब, जहर, उच्च तापमान या गैस्ट्रो esophageal refluxate घटक के रूप में पर्यावरणीय कारकों के लिए जोखिम के प्रभाव सहित अनुसंधान सवालों का एक नंबर की जांच करने के लिए चालाकी से किया जा सकता है। मॉडल भी सक्रिय करने के पारंपरिक 2 डी सेल संस्कृति, अन्य बातों के साथ साथ प्राप्त नहीं बढ़ाया संस्कृति अवधि की सुविधा, अप करने के लिए 20 दिनों के लिए ब्याज की एजेंट को एक परिपक्व उपकला के कई बार प्रदर्शन के प्रभाव का अध्ययन। इसके अलावा, इस तरह के esophageal ट्यूमर या बैरेट इतरविकसन से ली गई उन के रूप में सेल लाइनों की एक किस्म है, ऐसे ट्यूमर आक्रमण और नशीली दवाओं के responsivene के रूप में प्रक्रियाओं की जांच के लिए मॉडल में शामिल किया जा सकता हैएक और अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक वातावरण में एस एस।
Introduction
esophageal म्यूकोसा संयोजी ऊतक, लामिना propria की एक परत के ऊपर एक स्तरीकृत, स्क्वैमस उपकला शामिल हैं, और किया जाता पर्यावरण तनाव मुठभेड़ की पहली साइटों में से एक है। Duodenogastro esophageal भाटा esophageal ग्रंथिकर्कटता करने के लिए प्रगति की वृद्धि की जोखिम के साथ जुड़ा हुआ है जो बैरेट इतरविकसन, के रोगजनन में एक महत्वपूर्ण कारक है, जबकि आहार विषाक्त पदार्थों के संपर्क में, esophageal स्क्वैमस कार्सिनोमा के विकास में फंसा है। इसोफेजियल कार्सिनोमा ब्रिटेन पुरुषों और esophageal ग्रंथिकर्कटता में 8 वें सबसे आम घातक ट्यूमर को तेजी से पश्चिमी दुनिया 1 में बढ़ती जा रही है कर रहे हैं। इसके अलावा, लगभग 15% की समग्र 5 साल की जीवित रहने की दर के साथ रोग रोग का निदान में थोड़ा सुधार, कर दिया गया है। नतीजतन विकास में इस esophageal उपकला पर पर्यावरण तनाव के लिए जोखिम के प्रभाव और उनके संभावित संलिप्तता की जांच के लिए प्रयोगात्मक प्लेटफार्मों के लिए एक की जरूरत हैइतरविकसन या रसौली के pment।
अमर या ट्यूमर सेल लाइनों शोधकर्ताओं इन विट्रो में इन तनाव को उपकला कोशिकाओं की प्रतिक्रिया का अध्ययन करने की अनुमति है, वे प्रफलन रहते हैं और esophageal म्यूकोसा के ऊपरवाला परतों पर पाया परिपक्व उपकला कोशिकाओं में अंतर करने में विफल। इसके अलावा, पहले से ही tumorigenesis आया है कि कोशिकाओं लाइनों पर्यावरणीय कारकों के उपकला के भीतर सामान्य कोशिकाओं की प्रारंभिक प्रतिक्रिया के बारे में केवल सीमित जानकारी उपलब्ध करा सकता है; और इस चिकित्सकीय हस्तक्षेप के लिए संभावित उच्चतम हो सकता है जब मंच है। अंत में, पारंपरिक सेल संस्कृति प्रणालियों उपकला और mesenchymal कोशिकाओं के बीच और vivo में ऊतकों के भीतर होती है कि इन कोशिकाओं और आसपास के मैट्रिक्स के बीच संभावित महत्वपूर्ण बातचीत पर कब्जा करने में विफल।
पशु मॉडलों esophageal epitheli की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक और अधिक यथार्थवादी माइक्रोएन्वायरमेंट प्रदानउम और गैस्ट्रो esophageal भाटा रोग 2 की कृत्रिम प्रेरण शामिल कर सकते हैं। हालांकि यह इन मॉडलों में पर्यावरण तनाव में हेरफेर करने के लिए और अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है और वे पूरी तरह से मानव घेघा के भीतर प्रतिक्रिया का प्रतिनिधित्व नहीं कर सकते हैं।
अन्य प्रयोगात्मक मानव esophageal मॉडल एक कोलेजन पर प्राथमिक कोशिकाओं, अमर कोशिकाओं या ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग कि विकसित की है, या कोलेजन / Matrigel, पाड़ युक्त fibroblasts 3,4 संयुक्त किया गया है। यह इस पांडुलिपि में वर्णित अकोशिकीय esophageal पाड़ की तुलना में इन मचान उत्पन्न करने के लिए कम श्रम गहन है, और इन organotypic मॉडल विशेष रूप से कोलेजन जेल में ट्यूमर सेल घुसपैठ आसानी से किया जा सकता है, जहां ट्यूमर आक्रमण 5,6, के अध्ययन में एक उपयोगी उपकरण प्रदान मनाया। हालांकि इन कोलेजन जैल गैर देशी यांत्रिक गुण होते हैं और एक विशिष्ट तहखाने झिल्ली और appropriat सहित मूल ऊतक के कुछ सुविधाओं का अभावई सतह स्थलाकृति। एक कोलेजन जेल पाड़ 7 का उपयोग करते हैं तो यह, उदाहरण के लिए, उपकला और पाड़ के बीच गरीब आसंजन में जिसके परिणामस्वरूप कोशिकाओं के व्यवहार को प्रभावित कर सकते हैं। एक परिणाम के रूप में अकोशिकीय सुअर का esophageal पाड़ एक अधिक जैविक रूप से यथार्थवादी पाड़ और एक प्रयोगात्मक मंच के रूप में इस्तेमाल के लिए इस प्रकार अधिक उपयुक्त होने का लाभ के साथ, विकसित किया गया था। यह भी यह है कि इन कोशिकाओं को एक बहुस्तरीय उपकला फार्म के बाद से, इस तरह के हेट-1A के रूप में अमर esophageal उपकला कोशिका लाइनों, की तुलना में esophageal निर्माणों में प्राथमिक कोशिकाओं को शामिल लेकिन विभक्त हो जाना या 4,7,8 अंतर करने के लिए विफल करने के लिए बेहतर है कि दिखाया गया है ।
नतीजतन, इस प्रोटोकॉल पहले से ही ऊतक इंजीनियर त्वचा और मौखिक mucosa 9,10 बनाने के लिए मेकनेल प्रयोगशाला में प्रयोग में एक विधि से अनुकूलित और प्राथमिक मानव esophageal उपकला कोशिकाओं और fibroblasts के साथ संयुक्त एक डे-cellularized सुअर का esophageal पाड़ को शामिल किया गया है। थीCK4, CK14, Ki67 द्वारा और धुंधला involucrin के रूप में प्रदर्शन के प्रोटोकॉल सामान्य मानव घेघा के समान एक परिपक्व, स्तरीकृत उपकला, पैदा करता है। जिसके परिणामस्वरूप मॉडल पर्यावरण तनाव के लिए प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच प्रदान करता है, और घटकों 11 refluxate के जवाब में esophageal उपकला में जीन की अभिव्यक्ति में परिवर्तन की जांच करने के लिए प्रभावी ढंग से इस्तेमाल किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पांडुलिपि esophageal उपकला पर पर्यावरण तनाव के लिए जोखिम के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक मंच के रूप में उपयोग के लिए उपयुक्त एक जैविक रूप से प्रासंगिक मानव esophageal श्लैष्मिक मॉडल के उत्पादन और ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम esophageal ऊतकों के नमूनों और हमारे काम का उनके समर्थन प्राप्त करने में उनकी मदद के लिए, श्री रोजर अक्रोयद, श्री एंड्रयू वायमैन और श्री क्रिस Stoddard, शेफील्ड शिक्षण अस्पतालों एनएचएस फाउंडेशन ट्रस्ट में कंसल्टेंट सर्जन के लिए आभारी हैं। हम मॉडल में ट्यूमर सेल लाइनों को शामिल उनकी मदद के लिए अशरफुल हक धन्यवाद। हम कृतज्ञता बर्धन रिसर्च एंड एजुकेशन ट्रस्ट (ब्रेट) और यॉर्कशायर कैंसर रिसर्च (YCR) से अनुदान द्वारा इस अध्ययन के लिए वित्तीय सहायता को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
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