Produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un 3D tissutale umano esofageo mucose Modello

Summary

Questo manoscritto descrive la produzione, caratterizzazione e possibilità di utilizzo di un tessuto ingegnerizzato costrutto esofageo 3D preparati da normale fibroblasti esofageo umano primario e cellule epiteliali squamose seminate all'interno di un ponteggio suina de-cellularized. I risultati dimostrano la formazione di un epitelio stratificato maturo simile al normale esofago umano.

Abstract

L'incidenza di adenocarcinoma esofageo e il suo precursore, metaplasia di Barrett, sono in rapido aumento nel mondo occidentale. Inoltre adenocarcinoma esofageo ha in genere una prognosi infausta, con scarso miglioramento dei tassi di sopravvivenza negli ultimi anni. Queste sono condizioni difficili da studiare e vi è stata una mancanza di piattaforme sperimentali adatti per indagare i disturbi della mucosa esofagea.

Un modello della mucosa esofagea umano è stato sviluppato in laboratorio MacNeil che, a differenza dei sistemi di coltura cellulare 2D convenzionali, ricapitola le interazioni cellula-cellula e cellula-matrice presenti in vivo e produce un maturo, epitelio stratificato simile a quello della normale umana esofago. In breve, il modello si usano cellule non trasformate normali primari fibroblasti umani esofagee e epiteliali coltivate all'interno di un ponteggio acellulare esofageo suina di derivazione. Caratterizzazione immunoistochimica di questo modelloda CK4, CK14, Ki67 e involucrina colorazione dimostra adeguata ripresa del istologico della mucosa esofagea umano.

Questo modello fornisce un robusto, modello sperimentale biologicamente rilevanti della mucosa esofagea umana. Può essere facilmente manipolato per indagare su una serie di domande di ricerca, tra cui l'efficacia di agenti farmacologici e l'impatto dell'esposizione a fattori ambientali, come l'alcool, le tossine, ad alta temperatura o componenti refluito gastro-esofageo. Il modello facilita anche periodi prolungati di coltura non ottenibili con coltura cellulare convenzionale 2D, consentendo, tra l'altro, lo studio dell'impatto di esposizione ripetuta di un epitelio maturo per l'agente di interessi per un massimo di 20 giorni. Inoltre, una varietà di linee cellulari, come quelli derivati ​​da tumori esofagei o metaplasia di Barrett, può essere incorporata nel modello per studiare processi come invasione tumorale e responsivene drogass in un ambiente più biologicamente rilevante.

Introduction

La mucosa esofagea comprende una stratificato, epitelio squamoso sopra uno strato di tessuto connettivo, la lamina propria, ed è uno dei primi siti per incontrare stress ambientali ingeriti. L'esposizione a tossine alimentari è implicato nello sviluppo del carcinoma squamoso dell'esofago, mentre reflusso duodenogastro-esofageo è un fattore critico nella patogenesi della Barrett Metaplasia, che è associata ad un aumentato rischio di progressione di adenocarcinoma esofageo. Carcinomi esofagei sono l'8 ^° più comune tumore maligno nei maschi del Regno Unito e di adenocarcinoma esofageo è in rapido aumento nel mondo occidentale ^1. Inoltre, c'è stata poca miglioramento nella prognosi della malattia, con un tasso di sopravvivenza a 5 anni complessiva di circa il 15%. Di conseguenza, vi è la necessità per le piattaforme sperimentali per studiare l'impatto dell'esposizione a fattori di stress ambientali su questo epitelio esofageo e il loro potenziale coinvolgimento nella svipment di metaplasia o neoplasia.

Sebbene linee cellulari immortalizzate o tumorali permettono ai ricercatori di studiare la risposta delle cellule epiteliali a questi fattori di stress in vitro, rimangono proliferativa e non riescono a differenziarsi in cellule epiteliali mature trovate su gli strati superficiali della mucosa esofagea. Inoltre, linee cellulari che hanno già subito tumorigenesi possono fornire solo informazioni limitate per quanto riguarda le reazioni iniziali di cellule normali all'interno dell'epitelio a fattori ambientali; e questa è la fase in cui il potenziale di intervento terapeutico potrebbe essere più alta. Infine, i sistemi di coltura cellulare convenzionali non riescono a catturare le interazioni potenzialmente importanti tra cellule epiteliali e mesenchimali e tra queste cellule e la matrice circostante che si verificano all'interno dei tessuti in vivo.

Modelli animali forniscono un microambiente più realistico per studiare le risposte del epitheli esofageoum e può incorporare l'induzione artificiale della malattia da reflusso gastro-esofageo ^2. Tuttavia può essere più impegnativo per manipolare i fattori di stress ambientali in questi modelli, e non può rappresentare appieno la risposta entro dell'esofago umano.

Altri modelli sperimentali esofagee umani sono stati sviluppati che utilizzano cellule primarie, cellule immortalizzate o linee cellulari tumorali su un collagene, o combinati collagene / Matrigel, impalcatura contenenti fibroblasti ^3,4. È meno laborioso per generare questi scaffold rispetto al ponteggio esofageo acellulare descritto in questo manoscritto, e questi modelli organotipiche fornire uno strumento utile, in particolare nello studio di invasione del ^5,6, dove l'infiltrazione delle cellule tumorali nel gel di collagene può essere prontamente osservato. Tuttavia questi gel di collagene hanno non nativi proprietà meccaniche e mancano di alcune caratteristiche del tessuto originale, tra cui una membrana basale specifico e l'appropriate topografia della superficie. Ciò può influenzare il comportamento delle cellule con conseguente, ad esempio, più povera adesione tra l'epitelio e scaffold utilizzando un gel di collagene scaffold ^7. Di conseguenza è stato sviluppato il acellulare porcine scaffold esofageo, con il vantaggio di essere un ponteggio biologicamente più realistica e quindi più appropriato per l'uso come una piattaforma sperimentale. E 'stato anche dimostrato che è preferibile incorporare cellule primarie nei costrutti esofagee di linee cellulari immortalizzate esofagee epiteliali, come Het-1A, poiché queste cellule formano un epitelio multistrato ma non riescono a stratificare o differenziare ^4,7,8 .

Di conseguenza, questo protocollo è stato adattato da un metodo già in uso in laboratorio MacNeil per fare ingegneria tessutale della pelle e della mucosa orale ^9,10 e incorpora un porcine scaffold esofageo de-cellularized combinata con cellule primarie umane esofagee epiteliali e fibroblasti. Thiprotocollo s produce un maturo, epitelio stratificato, simile a quello della normale esofago umano come dimostrato da CK4, CK14, Ki67 e involucrin colorazione. Il modello risultante fornisce una piattaforma sperimentale per studiare le risposte ai fattori di stress ambientale, ed è stato utilizzato in modo efficace per studiare i cambiamenti nell'espressione genica nell'epitelio esofageo in risposta a refluito componenti ^11.

Protocol

Cellule esofagee umane sono ottenute da pazienti sottoposti a chirurgia gastrica o esofagea. Il consenso informato è ottenuto per il tessuto da utilizzare a scopo di ricerca, e il tessuto utilizzato in modo anonimo sotto le opportune approvazioni etiche (SSREC 165/03, Tessuto umano di ricerca Bank Licenza 12179). 1. Isolamento di cellule umane esofageo epiteliali Lavorando in una cappa coltura tissutale flusso laminare e con tecnica sterile, preparare il terreno di coltura epiteliale mescolando medio…

Representative Results

Questo manoscritto descrive il processo necessario, indicata schematicamente in figura 1, alla cultura modelli 3D dell'epitelio esofageo umana con successo. Per confermare l'idoneità del modello come una piattaforma sperimentale istologico e gli studi di immunoistochimica sono stati intrapresi confrontando i tessuti coltivati ​​con mucosa esofagea squamose umano. Valutazione istologica dell'epitelio prodotto con il metodo descritto mostra un maturo, multistr…

Discussion

Questo manoscritto descrive la produzione e caratterizzazione di un modello mucosa esofagea umana biologicamente rilevante adatto per l'uso come una piattaforma sperimentale per studiare l'impatto dell'esposizione a fattori di stress ambientali sulla dell'epitelio esofageo.

I passi più critici per la produzione di successo di un modello mucosa esofagea umano sono: garantire che la maggior parte delle cellule epiteliali rimangono proliferativa e non hanno già cominciato a di…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)