生産、特性評価および3D組織工学ヒト食道粘膜モデルの使用可能性
Summary
この原稿は、生産、特性評価および正常な初代ヒト食道線維芽細胞および脱細胞化ブタの足場内に播種した扁平上皮細胞から調製した組織工学3D食道構造物の潜在的な用途を説明しています。結果は、正常なヒトの食道に似成熟重層上皮の形成を実証します。
Abstract
食道腺癌およびその前駆体、バレット化生の両方の発生率は、西部の世界で急速に上昇しています。さらに、食道腺癌は、一般的に、近年の生存率にはほとんど改善して、予後不良を持っています。これらは、勉強する困難な状況であり、食道粘膜の障害を調査するために、適切な実験プラットフォームの欠如がありました。
ヒト食道粘膜のモデルは、従来の2D細胞培養系とは異なり、 生体内に存在する細胞-細胞及び細胞-マトリックス相互作用を再現すると、正常なヒトの場合と同様、成熟、重層上皮を生成する、マクニールの研究室で開発されました食道。簡単に言うと、モデルは、ブタ由来の無細胞食道足場内で増殖させた形質転換されていない正常な初代ヒト食道線維芽細胞および上皮細胞を利用します。このモデルの免疫組織化学的特性評価CK4、CK14によって、Ki67のとインボルクリン染色は、正常なヒト食道粘膜の組織学の適切な要約を示しています。
このモデルは、ヒトの食道粘膜の強固な、生物学的に関連する実験モデルを提供します。これは、簡単に薬剤の有効性と、アルコール、毒素、高温または胃食道refluxate部品などの環境要因への曝露の影響を含む研究課題の数を調査するために操作することができます。モデルはまた、最大20日間の関心のある物質に成熟した上皮の反復暴露の影響の研究を、 とりわけ可能、従来の2D細胞培養では達成できない、拡張培養期間を容易にします。さらに、このような食道腫瘍またはバレット化生に由来するものなどの細胞株、種々の、例えば、腫瘍浸潤および薬物responsiveneなどのプロセスを調査するためにモデルに組み込むことができますより生物学的に関連する環境でのSS。
Introduction
食道粘膜は、結合組織の層の上に層状、扁平上皮、粘膜固有層を含み、摂取環境ストレスに遭遇した最初のサイトの一つです。 duodenogastro食道逆流は、食道腺癌への進行のリスクの増加と関連しているバレット化生、の病因における重要な要因である一方、食物毒素への暴露は、食道扁平上皮癌の発症に関与しています。食道がんは、英国の男性と食道腺癌で8 番目の最も一般的な悪性腫瘍が急速に西洋世界1に増加しています。また、約15％の全5年生存率と疾患の予後でほとんど改善、がありました。したがってdeveloでこの食道上皮の環境ストレスへの曝露の影響とその潜在的な関与を調査するための実験的なプラットフォームが必要とされています化生または新生物のpment。
不死化または腫瘍細胞株は、研究者は、インビトロでこれらのストレスには、上皮細胞の応答を研究することを可能にするが、それらは、増殖性のままであり、食道粘膜の最上層上に見出される成熟上皮細胞に分化することができません。また、既に腫瘍形成を起こした細胞株は、環境要因に上皮内の正常細胞の初期応答に関する限られた情報を提供することができます。これは、治療的介入の可能性が最も高いとすることができるステージがあります。最後に、従来の細胞培養系は、上皮および間葉細胞の間でおよびインビボでの組織内で発生し、これらの細胞と周囲のマトリックスとの間の潜在的に重要な相互作用を捕捉することができません。
動物モデルは食道epitheliの応答を研究するためのより現実的な微小環境を提供しますUMと胃食道逆流症2の人工的誘導を組み込むことができます。しかし、これらのモデルにおける環境ストレスを操作するより困難にすることができ、それらは完全にヒトの食道内に応答を表していない場合があります。
他の実験、ヒト食道モデルは、コラーゲンの一次細胞、不死化細胞または腫瘍細胞株を利用する開発、またはコラーゲン/マトリゲル、足場を含む線維芽細胞3,4を合わせてきました。なお、この原稿に記載の無細胞食道足場よりもこれらの足場を生成するために少ない労働集約的であり、これらの器官のモデルは、コラーゲンゲル内への腫瘍細胞の浸潤を容易にすることができ、特に腫瘍浸潤5,6の研究に有用なツールを提供します観察しました。しかしながら、これらのコラーゲンゲルは、非天然の機械的特性を有し、特定の基底膜とappropriat含む元の組織の特定の機能を欠いていますEの表面トポグラフィー。これは、コラーゲンゲル骨組7を用いて、上皮と足場との間に、例えば、劣った接着をもたらす細胞の挙動に影響を与えることができます。その結果、無細胞ブタ食道足場は、より生物学的に現実的な足場と実験プラットフォームとして使用するための、より適切であるという利点と、開発されました。それはまた、これらの細胞が、多層上皮が形成するので、そのようなHET-1Aと不死化食道上皮細胞株、より食道構築物中に一次細胞を組み込むが、階層化または4,7,8を区別しない方が良いことが示されています。
したがって、このプロトコルは、組織工学皮膚や口腔粘膜9,10を製造するためのマクニールの研究室ですでに使用中の方法から適応し、初代ヒト食道上皮細胞および線維芽細胞と組み合わせた脱細胞化ブタ食道足場を内蔵しています。ティSプロトコルはCK4、CK14、Ki67をとインボルクリン染色によって示されるように、正常なヒト食道と同様の成熟した、重層上皮を生成します。得られたモデルは、環境ストレスへの応答を研究するための実験的なプラットフォームを提供し、成分11を refluxateに応答して食道上皮における遺伝子発現の変化を調査するために効果的に使用されてきました。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿は、食道上皮の際に環境ストレスへの暴露の影響を研究するための実験プラットフォームとして使用するのに適した生物学的に関連するヒト食道粘膜モデルの産生および特徴を説明しています。
ヒト食道粘膜モデルの成功の生産のための最も重要なステップは、次のとおりです。上皮細胞の大部分は、増殖のままであり、すでに足場上に播種する前に区別する?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、食道組織サンプルと私たちの仕事の支援獲得に彼らの助けのために、ミスターロジャーAckroyd氏アンドリュー·ワイマン氏とクリス·ストッダード、シェフィールド教育病院NHS財団トラストでのコンサルタント外科医に感謝しています。私たちはモデルに腫瘍細胞株を組み込んだ、彼の助けをAshrafulハクに感謝します。私たちは感謝Bardhan研究教育トラスト（BRET）とヨークシャー癌研究（YCR）からの補助金によって、この研究のための財政支援を認めます。
Materials
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- . Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells – investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
