Produção, Caracterização e usos potenciais de uma mucosa esofágica Modelo 3D Human Tissue-engenharia

Summary

Este manuscrito descreve a produção, caracterização e usos potenciais de uma engenharia de tecidos construção de esôfago 3D preparado a partir de fibroblastos de esôfago normais primária humana e células epiteliais escamosas semeadas dentro de um andaime porcino de-celularizado. Os resultados demonstram a formação de um epitélio estratificado maduro semelhante ao esófago humano normal.

Abstract

A incidência de ambos adenocarcinoma de esôfago e seu precursor, metaplasia de Barrett, estão a aumentar rapidamente no mundo ocidental. Adenocarcinoma de esôfago, além disso, geralmente tem um prognóstico pobre, com pouca melhora nas taxas de sobrevivência nos últimos anos. Estas são condições difíceis de estudar e tem havido uma falta de plataformas experimentais adequadas para investigar perturbações da mucosa esofágica.

Um modelo da mucosa esofágica humano foi desenvolvido no laboratório MacNeil que, ao contrário dos sistemas convencionais de cultura de células em 2D, recapitula as interacções célula-célula e célula-matriz presentes in vivo e produz, um epitélio estratificado maduro semelhante ao do ser humano normal esófago. Em resumo, o modelo utiliza células não transformadas fibroblastos humanos primários esofágicas epiteliais normais e cultivadas dentro de um andaime esofágica acelular derivada de porcino. Caracterização imuno-histoquímica desse modelopor CK4, CK14, Ki67 e involucrin coloração demonstra recapitulação adequada da histologia da mucosa do esôfago humano normal.

Este modelo fornece um modelo experimental robusto, biologicamente relevante da mucosa do esôfago humano. Ele pode ser facilmente manipulado para investigar um certo número de perguntas de investigação, incluindo a eficácia dos agentes farmacológicos e o impacto da exposição a factores ambientais tais como o álcool, toxinas, temperatura elevada ou de componentes do refluxo gastro-esofágico. O modelo também facilita a períodos prolongados de cultura não realizáveis ​​com a cultura de células em 2D convencional, permitindo, nomeadamente, o estudo dos efeitos da exposição repetida de um epitélio madura para o agente de interesse para até 20 dias. Além disso, uma variedade de linhas celulares, tais como as derivadas de tumores esofágicos ou metaplasia de Barrett, pode ser incorporado no modelo para investigar processos tais como a invasão do tumor e droga responsiveness em um ambiente mais biologicamente relevante.

Introduction

A mucosa esofágica compreende um epitélio estratificado, escamoso acima de uma camada de tecido conjuntivo, a lâmina, e é um dos primeiros locais para encontrar factores de stress ambientais ingeridos. A exposição a toxinas dieta está implicada no desenvolvimento de carcinoma escamoso esofágico, enquanto o refluxo duodenogastro-esofágica é um factor crítico na patogénese de metaplasia de Barrett, o qual está associado com um maior risco de progressão para adenocarcinoma esofágico. Carcinomas de esôfago são o ^8º tumor maligno mais comum no Reino Unido machos e adenocarcinoma de esôfago está a aumentar rapidamente no mundo ocidental ^1. Além disso, houve pouca melhora no prognóstico da doença, com uma taxa de sobrevida global em 5 anos de cerca de 15%. Consequentemente, há uma necessidade de plataformas experimentais para investigar o impacto da exposição a estressores ambientais sobre este epitélio esofágico e seu potencial envolvimento no desenvolvimento de metaplasia ou neoplasia.

Embora as linhas de células imortalizadas ou de tumor permitir que os investigadores a estudar a resposta de células epiteliais para estes factores de stress in vitro, eles permanecem proliferativa e não conseguem diferenciar-se em células epiteliais maduras encontradas nas camadas superiores da mucosa esofágica. Além disso, linhas de células que já tenham sido submetidos a tumorigénese pode fornecer informação limitada sobre as respostas iniciais de células normais dentro do epitélio a factores ambientais; e esta é a fase em que o potencial para intervenção terapêutica pode ser mais elevada. Finalmente, sistemas de cultura celular convencionais não conseguem capturar as interacções potencialmente importantes entre as células epiteliais e mesenquimais e entre estas células e a matriz circundante que ocorrem dentro de tecidos in vivo.

Modelos animais proporcionam um microambiente mais realista para estudar as respostas do epitheli esofágicahum e pode incorporar a indução artificial da doença do refluxo gastro-esofágico ^2. No entanto, pode ser mais difícil de manipular os estressores ambientais nesses modelos e eles podem não representar plenamente a resposta dentro do esôfago humano.

Outros modelos experimentais esofágicas humanos têm sido desenvolvidos que utilizam células primárias imortalizadas, células ou linhas celulares de tumor em um colagénio, ou combinado colagénio / Matrigel, andaime contendo fibroblastos ^3,4. É menos trabalho intensivo para gerar estes andaimes do que o andaime esofágica acelular descrito neste manuscrito, e estes modelos organotípicas proporcionam uma ferramenta útil, especialmente no estudo de invasão tumoral ^5,6, onde a infiltração de células tumorais no gel de colagénio pode ser prontamente observado. Contudo, estes géis de colagénio tem propriedades mecânicas não nativas e não têm certas características do tecido original, incluindo uma membrana basal específico e o appropriate superfície topografia. Este pode influenciar o comportamento das células, resultando em, por exemplo, adesão pobre entre o epitélio e andaime quando utilizando um gel de colagénio ⁷ andaime. Como consequência, o andaime esofágica porcino acelular foi desenvolvido, com a vantagem de ser um andaime biologicamente mais realista e, portanto, mais adequada para o uso como uma plataforma experimental. Também tem sido demonstrado que é melhor para incorporar células primárias para as construções esofágicas do que as linhas celulares imortalizadas esofágicas epiteliais, tais como Het-1A, uma vez que estas células formam um epitélio de múltiplas camadas, mas não conseguem diferenciar ou estratificar ^4,7,8 .

Por conseguinte, este protocolo foi adaptado a partir de um método já em uso no laboratório MacNeil para fazer o tecido da pele e mucosa oral engenharia ^9,10 e incorpora um andaime de esôfago porcino de-celularizado combinado com células humanas primárias do esôfago epiteliais e fibroblastos. This protocolo produz, um epitélio estratificado maduro, semelhante ao do esófago humano normal como demonstrado por CK4, CK14, Ki67 e involucrina coloração. O modelo resultante proporciona uma plataforma experimental para estudar as respostas a factores de stress ambientais, e tem sido utilizada eficazmente para estudar alterações na expressão do gene no epitélio esofágico em resposta ao material refluído componentes ^11.

Protocol

Células do esôfago humanos são obtidos a partir de pacientes submetidos à cirurgia gástrica ou esofágica. O consentimento informado é obtido para o tecido a ser usado para fins de pesquisa, eo tecido usado de forma anônima sob as aprovações éticas adequadas (SSREC 165/03, Tissue Research Humano Banco Licence 12179). 1. Isolamento de esôfago humano células epiteliais Trabalhando em fluxo laminar capuz de cultura de tecidos e utilizando uma técnica estéril, preparar o meio de cultura epit…

Representative Results

Este manuscrito descreve o processo necessário, mostrado de forma esquemática na Figura 1, a cultura de modelos em 3D do epitélio humano esofágica com sucesso. Para confirmar a adequação do modelo como uma plataforma experimental histológica e imuno-histoquímica estudos foram realizados comparando com os tecidos cultivados mucosa escamosa esofágica humano normal. A avaliação histológica do epitélio produzida pelo método descrito mostra um, de múltiplas camadas…

Discussion

Este manuscrito descreve a produção e caracterização de um modelo biologicamente relevante da mucosa esofágica humana adequada para utilização como uma plataforma experimental para estudar o impacto da exposição a factores de stress ambientais sobre o epitélio esofágico.

Os passos mais críticos para o sucesso da produção de um modelo da mucosa esofágica humano são: assegurando que a maior parte das células epiteliais permanecem proliferativa e não ter já começado a difere…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)