Производственные, характеристики и потенциальные возможности использования в 3D тканевой инженерии человека пищевода слизистой модели
Summary
Эта рукопись описывает производства, характеристика и возможности использования ткани инженерии 3D пищевода конструкта, полученного из нормальной первичной пищевода фибробластов человека и клеток плоского эпителия, посеянных в свиной эшафот де-cellularized. Полученные результаты показывают, формирование зрелого стратифицированного эпителия подобна нормальной человеческой пищевода.
Abstract
Заболеваемость как аденокарциномы пищевода и его предшественник, метаплазия Барретта, быстро растет в западном мире. Кроме того аденокарциномы пищевода, как правило, имеет плохой прогноз, с небольшим улучшением выживаемости в последние годы. Это трудные условия для изучения и было отсутствие подходящих экспериментальных площадок по расследованию нарушений слизистой оболочки пищевода.
Модель слизистой оболочки пищевода человека был разработан в лаборатории Макнил, который, в отличие от обычных систем 2D клеточной культуры, повторяет клетке-клетка и клетка-матрица взаимодействий, присутствующих в естественных условиях, и производит зрелый многослойный эпителий, аналогичной той, что нормального человека пищевода. Вкратце, эта модель использует нетрансформированные нормальные первичные фибробласты человека пищевода и эпителиальные клетки, выращенные в бесклеточной пищевода помост свиного происхождения. Иммуногистохимическое характеристика этой моделипо CK4, CK14, Ki67 и инволюкрина окрашивание демонстрирует соответствующий суммировании гистологии нормальной слизистой оболочки пищевода человека.
Эта модель обеспечивает надежную, биологически соответствующий экспериментальную модель слизистой оболочки пищевода человека. Это может быть легко манипулировать, чтобы исследовать ряд исследовательских вопросов, включая эффективности фармакологических агентов и последствий воздействия факторов окружающей среды, таких как алкоголь, токсины, высокая температура или желудочно-пищеводного компонентов рефлюксата. Модель также способствует длительные периоды не достижимые с обычным 2D культуры клеток, позволяя, в частности культуры, изучение влияния многократного воздействия зрелой эпителия агента интерес на срок до 20 дней. Кроме того, различные клеточные линии, такие как соли, полученные из опухолей или пищевода Барретта метаплазии, могут быть включены в модель, чтобы исследовать процессы, такие как инвазии опухоли и наркотиков responsiveneсс в более биологически соответствующий среде.
Introduction
Слизистой оболочки пищевода включает слоистую, плоскоклеточный эпителий выше слоя соединительной ткани, в собственной пластинке, и является одним из первых сайтов, сталкиваются попадании экологических стрессоров. Воздействие диетических токсинов участвует в развитии плоскоклеточного рака пищевода, в то время как duodenogastro-пищеводного рефлюкса является критическим фактором в патогенезе метаплазии Барретта, который связан с повышенным риском прогрессирования аденокарциномы пищевода. Пищевода карцином 8-й наиболее частой злокачественной опухоли в Великобритании мужчин и аденокарциномы пищевода быстро растет в западном мире 1. Кроме того, было небольшое улучшение прогноза заболевания в, с общим уровнем 5-летняя выживаемость составляет около 15%. Следовательно, существует потребность в экспериментальных площадок для расследования последствий воздействия экологического стресса на этом эпителия пищевода и их возможного участия в Develoмат ветствующую защитную эк метаплазии или неоплазии.
Несмотря на то, иммортализованных или опухолевых клеточных линий позволяют исследователей изучать реакцию эпителиальных клеток в этих стресса в пробирке, они остаются пролиферативной и не дифференцируются в зрелых эпителиальных клеток, найденных на самых верхних слоев слизистой оболочки пищевода. Кроме того, клеточные линии, которые уже подверглись туморогенез может обеспечить только ограниченную информацию о начальных ответов нормальных клеток в эпителии экологических факторов; и это этап, когда потенциал для терапевтического вмешательства может быть высокой. Наконец, обычные системы для культивирования клеток не в состоянии захватить потенциально важные взаимодействия между эпителиальных и мезенхимальных клеток и между этими клетками и окружающей матрицы, которые происходят в тканях в естественных условиях.
Животные модели обеспечивают более реалистичное микросреду для изучения реакции пищевода epitheliмкм и может включать искусственный индукцию желудочно-пищеводного рефлюкса 2. Однако он может быть более сложным, чтобы манипулировать экологических стрессоров в этих моделях, и они не могут в полной мере представлять ответ в человеческом пищевода.
Другие экспериментальные модели человека пищевода были разработаны, которые используют первичные клетки, иммортализованных клеток или клеточных линий опухоли на коллаген, коллаген или в сочетании / Матригель, содержащие каркас фибробласты 3,4. Это менее трудоемким, чтобы генерировать эти каркасы, чем бесклеточной пищевода помост, описанной в этой рукописи, и эти модели обеспечивают органотипической полезный инструмент, особенно при исследовании опухолевой инвазии 5,6, где опухоль клеточной инфильтрации в гель коллагена может быть легко наблюдается. Однако эти гели коллагена неродного механические свойства и не имеют определенные функции исходной ткани, в том числе конкретного базальной мембраны и appropriatе топографии поверхности. Это может влиять на поведение клеток, в результате, например, хуже адгезии между эпителием и строительные леса при использовании гель каркас коллагена 7. Как следствие был разработан бесклеточной свиного пищевода каркас, с тем преимуществом, что более реалистично биологически каркас и, таким образом, более подходящим для использования в качестве экспериментальной площадки. Кроме того, было показано, что лучше включать первичных клеток в пищеводе конструкций, чем иммортализованных пищевода эпителиальных клеточных линий, таких как Het-1A, так как эти клетки образуют многослойный эпителий, но не для стратификации или дифференциации 4,7,8 ,
Следовательно, этот протокол был адаптирован из метода уже используются в лаборатории Макнил для принятия тканей инженерии кожи и слизистой оболочки полости рта 9,10 и включает в себя свиной пищевода эшафот де-cellularized сочетании с первичных человеческих клетках эпителия пищевода и фибробластов. Тхис протоколом производит зрелый, стратифицированного эпителия, подобную нормальной человеческой пищевода, как продемонстрировано CK4, CK14, Ki67 и инволюкрина окрашивания. Полученная модель обеспечивает экспериментальную площадку для изучения ответов на экологический стресс, и был эффективно использован для исследования изменений в экспрессии генов в эпителии пищевода в ответ на рефлюксата компоненты 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта рукопись описывает производство и характеристика биологически соответствующего модели человеческого пищевода слизистой подходящей для использования в качестве экспериментальной площадки для изучения последствий воздействия экологического стресса на эпителия пищевода.
<p cla…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны г-ну Роже Акройд, г-Эндрю Вайман и г Крис Стоддард, консультант хирургов в Шеффилд больницах NHS Trust Foundation, за их помощь в приобретении образцов ткани пищевода и их поддержку нашей работы. Мы благодарим Ashraful Хак за помощь включения линии опухолевых клеток в модели. Мы выражаем глубокую признательность за финансовую поддержку исследования по грантам от исследований и образования Trust Сабир (BRET) и йоркширский исследований рака (YCR).
Materials
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- . Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells – investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
