Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

Summary

Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal.

Abstract

La incidencia tanto de adenocarcinoma de esófago y su precursor, metaplasia de Barrett, están aumentando rápidamente en el mundo occidental. Además adenocarcinoma esofágico generalmente tiene un pronóstico pobre, con pocas mejoras en las tasas de supervivencia en los últimos años. Estas son las condiciones difíciles de estudiar y no ha habido una falta de plataformas experimentales adecuados para investigar los trastornos de la mucosa esofágica.

Un modelo de la mucosa esofágica humano ha sido desarrollado en el laboratorio MacNeil que, a diferencia de los sistemas de cultivo de células 2D convencionales, recapitula las interacciones célula-célula y célula-matriz presentes in vivo y produce un epitelio estratificado maduro similar a la de la humano normal esófago. Brevemente, el modelo utiliza células no transformadas normales fibroblastos humanos primarios esofágicas y epiteliales cultivadas dentro de un andamio acelular de esófago de origen porcino. Caracterización inmunohistoquímica de este modelopor CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción demuestra recapitulación apropiado de la histología de la mucosa esofágica humano normal.

Este modelo proporciona un modelo experimental robusto, biológicamente relevante de la mucosa esofágica humano. Puede ser fácilmente manipulado para investigar una serie de preguntas de investigación, incluyendo la eficacia de agentes farmacológicos y el impacto de la exposición a factores ambientales tales como el alcohol, las toxinas, alta temperatura o componentes el reflujo gastro-esofágico. El modelo también facilita períodos prolongados de cultivo no alcanzables con cultivo celular 2D convencional, lo que permite, entre otras cosas, el estudio del impacto de la exposición repetida de un epitelio maduro para el agente de interés para un máximo de 20 días. Además, una variedad de líneas celulares, tales como las derivadas de tumores de esófago o metaplasia de Barrett, se puede incorporar en el modelo para investigar procesos tales como la invasión tumoral y responsivene drogasss en un entorno más biológicamente relevante.

Introduction

La mucosa esofágica comprende un epitelio escamoso estratificado por encima de una capa de tejido conectivo, la lámina propia, y es uno de los primeros sitios para encontrar factores de estrés ambiental ingeridos. La exposición a las toxinas alimentarias está implicado en el desarrollo del carcinoma escamoso de esófago, mientras que el reflujo esofágico duodenogastro es un factor crítico en la patogénesis de la metaplasia de Barrett, que se asocia con un mayor riesgo de progresión a adenocarcinoma esofágico. Carcinomas esofágicos son la ^8ª tumor maligno más común en los hombres del Reino Unido y el adenocarcinoma de esófago está aumentando rápidamente en el mundo occidental ^1. Por otra parte, ha habido pocas mejoras en el pronóstico de la enfermedad, con una tasa de supervivencia global a 5 años de alrededor del 15%. En consecuencia, existe una necesidad de plataformas experimentales para investigar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en este epitelio esofágico y su potencial implicación en la Developo de metaplasia o neoplasia.

Aunque las líneas celulares inmortalizadas o tumorales permiten a los investigadores para estudiar la respuesta de las células epiteliales a estos factores de estrés in vitro, siguen siendo proliferativa y fallan a diferenciarse en las células epiteliales maduros que se encuentran en las capas superiores de la mucosa esofágica. Además, las líneas de células que ya han sido sometidos a la tumorigénesis pueden proporcionar información limitada sobre las respuestas iniciales de las células normales dentro del epitelio a factores ambientales; y esta es la etapa en la que el potencial para la intervención terapéutica puede ser más alto. Finalmente, los sistemas de cultivo de células convencionales no logran captar las interacciones potencialmente importantes entre células epiteliales y mesenquimales y entre estas células y la matriz circundante que ocurren dentro de los tejidos in vivo.

Los modelos animales proporcionan un microambiente más realista para el estudio de las respuestas de la epitheli esofágicoum y puede incorporar la inducción artificial de la enfermedad de reflujo gastro-esofágico ^2. Sin embargo, puede ser más difícil de manipular los factores de estrés ambientales en estos modelos y que puede no representar plenamente la respuesta dentro del esófago humano.

Otros modelos esofágicas humanos experimentales se han desarrollado que utilizan células primarias, células inmortalizadas o líneas de células tumorales en un colágeno, fibroblastos o combinado colágeno / Matrigel, andamio que contienen ^3,4. Es menos mano de obra para generar estos andamios que el andamio de esófago acelular descrito en este manuscrito, y estos modelos organotípicos proporcionan una herramienta útil, en particular en el estudio de la invasión tumoral ^5,6, donde la infiltración de células tumorales en el gel de colágeno puede ser fácilmente observado. Sin embargo, estos geles de colágeno tienen propiedades mecánicas no nativos y carecen de ciertas características del tejido original, incluyendo una membrana basal específico y el appropriattopografía de la superficie e. Esto puede influir en el comportamiento de las células resultantes en, por ejemplo, más pobre adhesión entre el epitelio y el andamio cuando se utiliza un andamio de gel de colágeno ^7. Como consecuencia de ello se desarrolló el andamio de esófago porcino acelular, con la ventaja de ser un andamio biológicamente más realista y por lo tanto más apropiado para su uso como una plataforma experimental. También se ha demostrado que es mejor para incorporar células primarias en las construcciones de esófago que inmortalizadas líneas de células epiteliales del esófago, tales como Het-1A, ya que estas células forman un epitelio multicapa, pero no para estratificar o diferenciar ^4,7,8 .

En consecuencia, este protocolo ha sido adaptado de un método ya en uso en el laboratorio MacNeil para la fabricación de tejidos de la piel y mucosa oral ingeniería ^9,10 e incorpora un andamio de esófago porcino-de cellularized combinado con células esofágicas humanas primarias epiteliales y fibroblastos. Thiprotocolo s produce un epitelio estratificado maduro, similar a la de la esófago humano normal como se demuestra por CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción. El modelo resultante proporciona una plataforma experimental para estudiar las respuestas a factores de estrés ambiental, y se ha utilizado eficazmente para investigar los cambios en la expresión génica en el epitelio esofágico en respuesta a el reflujo componentes ^11.

Protocol

Células esofágicas humanas se obtuvieron a partir de pacientes sometidos a cirugía gástrica o esofágica. Se obtuvo el consentimiento informado para que el tejido se puede utilizar con fines de investigación, y el tejido utilizado de forma anónima bajo las aprobaciones éticas adecuadas (SSREC 165/03, Tejido humano de investigación del Banco de licencia 12179). 1. Aislamiento de células humanas epiteliales del esófago Trabajando en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar y utilizan…

Representative Results

Este manuscrito describe el proceso requerido, que se muestra en forma esquemática en la Figura 1, para cultivo de modelos 3D del epitelio esofágico humano con éxito. Para confirmar la idoneidad del modelo como una plataforma experimental histológico y estudios inmunohistoquímicos han llevado a cabo la comparación de los tejidos cultivados con mucosa escamosa esofágica humano normal. Evaluación histológica del epitelio producido por el método descrito muestra una, …

Discussion

Este manuscrito describe la producción y caracterización de un modelo de la mucosa esofágica humana biológicamente relevante adecuado para uso como una plataforma experimental para estudiar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en el epitelio esofágico.

Los pasos más críticos para el éxito de la producción de un modelo de la mucosa esofágica humana son: asegurar que la mayoría de las células epiteliales permanecen proliferativa y no lo ha comenzado a dife…

Materials

Trypsin	BD Biosciences	215240	Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use
DMEM	Labtech	LM-D1112	Warm in 37°C water bath before use
Ham's F12	Labtech	LM-H1236	Warm in 37°C water bath before use
Foetal Calf Serum	Labtech	FB-1090
Epidermal Growth Factor	R+D Systems	236-EG-200	Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS
Hydorcortisone	Sigma-Aldrich	H0396	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Adenine	Sigma-Aldrich	A2786	Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use
Insulin	Sigma-Aldrich	I2767	Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use
Transferrin	Sigma-Aldrich	T2036	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Triiodothyronine	Sigma-Aldrich	T2752	Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use
Cholera toxin	Sigma-Aldrich	C8052	Prepare stock solution in water
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P0781
Amphotericin B	Gibco	15290-026	Brand name Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise
Collagenase A	Roche	10103578001
Povidone-iodine solution	Ecolab	10830E	Brand name Videne
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
NaCl	Sigma-Aldrich	433209	Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G2025	Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min)
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
Newborn calf serum	Gibco	26010074
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Ethanolamine	Sigma-Aldrich	E9508	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use
O-phosphorylethanolamine	Sigma-Aldrich	P0503	Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use
ITS (insulin, transferrin, selenium)	Lonza	17-838Z	Used for composite media preparation
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	Warm in 37°C water bath before use
EDTA 0.02% solution	Sigma-Aldrich	E8008	Warm in 37°C water bath before use
T75 culture flask	VWR	734-2313
50 ml centrifuge tube	Fisher	11819650
15 ml universal tube	SLS	SLS7504
180 ml pot	VWR	216-2603
Petri dish	SLS	150350
6 well plate	VWR	734-2323
stainless steel rings			Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm
steel mesh grids			Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h)
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	Clone MM1 Use at 1:100
CK4	Abcam	ab9004	Clone 6B10 Use at 1:200
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	Clone LL002 Use at 1:200
Involucrin	Novocastra	INV	Clone  SY5 Use at 1:100
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
Mouse 3T3 fibroblasts	ATCC-LGC	CRL-1658	previously growth arrested by irradiation (60 Gy)