Este manuscrito describe la producción, caracterización y usos potenciales de un constructo de ingeniería tisular esofágico 3D preparado a partir de fibroblastos humanos primarios normales de esófago y las células epiteliales escamosas sembradas dentro de un andamio-de cellularized porcino. Los resultados demuestran la formación de un epitelio estratificado maduro similar al esófago humano normal.
La incidencia tanto de adenocarcinoma de esófago y su precursor, metaplasia de Barrett, están aumentando rápidamente en el mundo occidental. Además adenocarcinoma esofágico generalmente tiene un pronóstico pobre, con pocas mejoras en las tasas de supervivencia en los últimos años. Estas son las condiciones difíciles de estudiar y no ha habido una falta de plataformas experimentales adecuados para investigar los trastornos de la mucosa esofágica.
Un modelo de la mucosa esofágica humano ha sido desarrollado en el laboratorio MacNeil que, a diferencia de los sistemas de cultivo de células 2D convencionales, recapitula las interacciones célula-célula y célula-matriz presentes in vivo y produce un epitelio estratificado maduro similar a la de la humano normal esófago. Brevemente, el modelo utiliza células no transformadas normales fibroblastos humanos primarios esofágicas y epiteliales cultivadas dentro de un andamio acelular de esófago de origen porcino. Caracterización inmunohistoquímica de este modelopor CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción demuestra recapitulación apropiado de la histología de la mucosa esofágica humano normal.
Este modelo proporciona un modelo experimental robusto, biológicamente relevante de la mucosa esofágica humano. Puede ser fácilmente manipulado para investigar una serie de preguntas de investigación, incluyendo la eficacia de agentes farmacológicos y el impacto de la exposición a factores ambientales tales como el alcohol, las toxinas, alta temperatura o componentes el reflujo gastro-esofágico. El modelo también facilita períodos prolongados de cultivo no alcanzables con cultivo celular 2D convencional, lo que permite, entre otras cosas, el estudio del impacto de la exposición repetida de un epitelio maduro para el agente de interés para un máximo de 20 días. Además, una variedad de líneas celulares, tales como las derivadas de tumores de esófago o metaplasia de Barrett, se puede incorporar en el modelo para investigar procesos tales como la invasión tumoral y responsivene drogasss en un entorno más biológicamente relevante.
La mucosa esofágica comprende un epitelio escamoso estratificado por encima de una capa de tejido conectivo, la lámina propia, y es uno de los primeros sitios para encontrar factores de estrés ambiental ingeridos. La exposición a las toxinas alimentarias está implicado en el desarrollo del carcinoma escamoso de esófago, mientras que el reflujo esofágico duodenogastro es un factor crítico en la patogénesis de la metaplasia de Barrett, que se asocia con un mayor riesgo de progresión a adenocarcinoma esofágico. Carcinomas esofágicos son la 8ª tumor maligno más común en los hombres del Reino Unido y el adenocarcinoma de esófago está aumentando rápidamente en el mundo occidental 1. Por otra parte, ha habido pocas mejoras en el pronóstico de la enfermedad, con una tasa de supervivencia global a 5 años de alrededor del 15%. En consecuencia, existe una necesidad de plataformas experimentales para investigar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en este epitelio esofágico y su potencial implicación en la Developo de metaplasia o neoplasia.
Aunque las líneas celulares inmortalizadas o tumorales permiten a los investigadores para estudiar la respuesta de las células epiteliales a estos factores de estrés in vitro, siguen siendo proliferativa y fallan a diferenciarse en las células epiteliales maduros que se encuentran en las capas superiores de la mucosa esofágica. Además, las líneas de células que ya han sido sometidos a la tumorigénesis pueden proporcionar información limitada sobre las respuestas iniciales de las células normales dentro del epitelio a factores ambientales; y esta es la etapa en la que el potencial para la intervención terapéutica puede ser más alto. Finalmente, los sistemas de cultivo de células convencionales no logran captar las interacciones potencialmente importantes entre células epiteliales y mesenquimales y entre estas células y la matriz circundante que ocurren dentro de los tejidos in vivo.
Los modelos animales proporcionan un microambiente más realista para el estudio de las respuestas de la epitheli esofágicoum y puede incorporar la inducción artificial de la enfermedad de reflujo gastro-esofágico 2. Sin embargo, puede ser más difícil de manipular los factores de estrés ambientales en estos modelos y que puede no representar plenamente la respuesta dentro del esófago humano.
Otros modelos esofágicas humanos experimentales se han desarrollado que utilizan células primarias, células inmortalizadas o líneas de células tumorales en un colágeno, fibroblastos o combinado colágeno / Matrigel, andamio que contienen 3,4. Es menos mano de obra para generar estos andamios que el andamio de esófago acelular descrito en este manuscrito, y estos modelos organotípicos proporcionan una herramienta útil, en particular en el estudio de la invasión tumoral 5,6, donde la infiltración de células tumorales en el gel de colágeno puede ser fácilmente observado. Sin embargo, estos geles de colágeno tienen propiedades mecánicas no nativos y carecen de ciertas características del tejido original, incluyendo una membrana basal específico y el appropriattopografía de la superficie e. Esto puede influir en el comportamiento de las células resultantes en, por ejemplo, más pobre adhesión entre el epitelio y el andamio cuando se utiliza un andamio de gel de colágeno 7. Como consecuencia de ello se desarrolló el andamio de esófago porcino acelular, con la ventaja de ser un andamio biológicamente más realista y por lo tanto más apropiado para su uso como una plataforma experimental. También se ha demostrado que es mejor para incorporar células primarias en las construcciones de esófago que inmortalizadas líneas de células epiteliales del esófago, tales como Het-1A, ya que estas células forman un epitelio multicapa, pero no para estratificar o diferenciar 4,7,8 .
En consecuencia, este protocolo ha sido adaptado de un método ya en uso en el laboratorio MacNeil para la fabricación de tejidos de la piel y mucosa oral ingeniería 9,10 e incorpora un andamio de esófago porcino-de cellularized combinado con células esofágicas humanas primarias epiteliales y fibroblastos. Thiprotocolo s produce un epitelio estratificado maduro, similar a la de la esófago humano normal como se demuestra por CK4, CK14, Ki67 y involucrina tinción. El modelo resultante proporciona una plataforma experimental para estudiar las respuestas a factores de estrés ambiental, y se ha utilizado eficazmente para investigar los cambios en la expresión génica en el epitelio esofágico en respuesta a el reflujo componentes 11.
Este manuscrito describe la producción y caracterización de un modelo de la mucosa esofágica humana biológicamente relevante adecuado para uso como una plataforma experimental para estudiar el impacto de la exposición a factores de estrés ambientales en el epitelio esofágico.
Los pasos más críticos para el éxito de la producción de un modelo de la mucosa esofágica humana son: asegurar que la mayoría de las células epiteliales permanecen proliferativa y no lo ha comenzado a dife…
The authors have nothing to disclose.
Estamos muy agradecidos con el Sr. Roger Ackroyd, el Sr. Andrew Wyman y el Sr. Chris Stoddard, Consultor cirujanos en Sheffield Teaching Hospitals NHS Foundation Trust, por su ayuda en la adquisición de las muestras de tejido del esófago y su apoyo a nuestro trabajo. Agradecemos Ashraful Haque por su ayuda que incorpora líneas de células tumorales en el modelo. Agradecemos el apoyo financiero para este estudio por las subvenciones del Bardhan Investigación y Educación Trust (BRET) y Yorkshire Cancer Research (YCR).
Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
Petri dish | SLS | 150350 | |
6 well plate | VWR | 734-2323 | |
stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |