Produktion, karakterisering och potentiella användningsområdena för en 3D vävnadstekniska Human Esophageal Mucosal Modell
Summary
Detta manuskript beskriver framställning, karakterisering och potentiella användningsområdena för en vävnadsteknisk 3D matstrupen konstruktion framställd från normal primära humana matstrupen fibroblaster och skiv epitelceller seedade i en de-cellularized svin schavotten. Resultaten visar bildningen av en mogen stratifierat epitel liknande det normala mänskliga matstrupen.
Abstract
Förekomsten av både esofagusadenokarcinom och dess föregångare, Barretts Metaplasi, stiger snabbt i västvärlden. Vidare esofagusadenokarcinom har i allmänhet en dålig prognos, med liten förbättring i överlevnaden under senare år. Dessa är svåra förhållanden för att studera och det har varit brist på lämpliga experimentella plattformar för att undersöka sjukdomar i esofagus slemhinnan.
En modell av det mänskliga matstrupen slemhinnan har utvecklats i MacNeil laboratorium som, till skillnad från konventionella 2D cellodlingssystem, rekapitulerar cell-cell- och cell-matrix interaktioner närvarande in vivo och ger en mogen, stratifierat epitel som liknar den hos normala humana matstrupen. I korthet utnyttjar modellen icke-transforme normala primära humana matstrupen fibroblaster och epitelceller odlade i en svin härrörande acellulära matstrupen schavotten. Immunohistokemisk karakterisering av denna modellav CK4, CK14, Ki67 och involukrin färgning visar lämplig rekapitulation av histologi av den normala mänskliga esofagus slemhinna.
Denna modell ger en robust, biologiskt relevanta experimentell modell av det mänskliga esofagus slemhinnan. Det kan lätt manipuleras för att utreda ett antal forskningsfrågor, inklusive effekten av farmakologiska medel och effekterna av exponering för miljöfaktorer såsom alkohol, toxiner, hög temperatur eller mag-esofagus refluxate komponenter. Modellen underlättar också längre odlingsperioder som inte kan uppnås med konventionell 2D cellodling, som gör det möjligt, bland annat studier av effekterna av upprepad exponering av en mogen epitel till agenten av intresse för upp till 20 dagar. Vidare är en mängd olika cellinjer, såsom sådana härledda från esofageala tumörer eller Barretts Metaplasi, kan införlivas i modellen för att undersöka processer såsom tumörinvasion och drog responsiveness på ett mer biologiskt relevant miljö.
Introduction
Esofagus slemhinnan innefattar en skiktad, skivepitel ovanför ett skikt av bindväv, lamina propria, och är en av de första platserna att stöta intagna miljöpåverkande faktorer. Exponering för kost gifter är inblandad i utvecklingen av esofagus skivepitelcancer cancer, medan duodenogastro reflux är en kritisk faktor i patogenesen av Barretts Metaplasi, vilket är förenat med ökad risk för progression till esofagusadenokarcinom. Esofagus carcinom är de 8: e vanligaste maligna tumören i brittiska män och esofagusadenokarcinom ökar snabbt i västvärlden 1. Dessutom har det varit liten förbättring i sjukdomsprognos, med en total 5-års överlevnad på cirka 15%. Följaktligen finns det ett behov av experimentella plattformar för att undersöka effekterna av exponering för miljöpåverkande faktorer på denna matstrupen epitel och deras potentiella inblandning i development av metaplasi eller neoplasi.
Även odödliga eller tumörcellinjer tillåta forskare att studera svaret från epitelceller till dessa faktorer in vitro, förblir de proliferativa och misslyckas med att differentiera till de mogna epitelceller som finns på de översta skikten i esofagus slemhinnan. Dessutom kan cellinjer som redan har genomgått tumorigenes ger endast begränsad information om de första svaren från normala celler i epitelet till miljöfaktorer; och detta är det skede när potentialen för terapeutisk intervention kan vara högst. Slutligen, konventionella cellodlingssystem inte fånga de potentiellt viktiga samspelet mellan epiteliala och mesenkymala celler och mellan dessa celler och den omgivande matris som förekommer i vävnader in vivo.
Djurmodeller ger en mer realistisk mikromiljö för att studera svaren från esofagus epithelium och kan införliva den konstgjorda induktion av gastroesofageal refluxsjukdom 2. Men det kan vara svårare att manipulera miljöpåverkande faktorer i dessa modeller och de kan inte helt representativ för svar inom den mänskliga matstrupen.
Andra experimentella mänskliga matstrupen modeller har utvecklats som utnyttjar primära celler, odödliggjorda celler eller tumörcellinjer på en kollagen, eller kombinerad kollagen / Matrigel, byggnadsställning som innehåller fibroblaster 3,4. Det är mindre arbetskrävande att skapa dessa ställningar än acellulära matstrupen ställningen som beskrivs i detta manuskript, och dessa organotypiska modeller ger ett användbart verktyg, särskilt i studier av tumörinvasion 5,6, där tumörcellinfiltration i kollagengelen kan vara lätt observerats. Men dessa kollagengeler har främmande mekaniska egenskaper och saknar vissa funktioner i den ursprungliga vävnaden, inklusive en specifik basalmembranet och appropriate yttopografi. Detta kan påverka beteendet hos celler som resulterar i, till exempel, sämre vidhäftning mellan epitel och ställningen när du använder en kollagengel byggnadsställning 7. Som en följd det acellulära porcint esofageal scaffold utvecklades, med fördelen av att vara en mer biologiskt realistisk byggnadsställning och således mer lämpligt för användning som en experimentell plattform. Det har också visat sig att det är bättre att inkorporera primära celler in i esofagus konstruktionerna än immortaliserade esofagus epitelcellinjer, såsom Het-1A, eftersom dessa celler bildar en flerskiktad epitel men misslyckas med att skikta eller differentiera 4,7,8 .
Följaktligen har detta protokoll anpassats från en metod som redan används i MacNeil laboratorium för framställning av vävnadsteknisk huden och munslemhinnan 9,10 och innehåller en de-cellularized svin matstrupen byggnadsställning i kombination med primära humana esofagus epitelceller och fibroblaster. This-protokollet ger en mogen, stratifierat epitel, liknande den för den normala humana esofagus vilket framgår av CK4, CK14, Ki67 och involukrin färgning. Den resulterande modellen ger en experimentell plattform för att studera reaktioner på miljöfaktorer, och har använts på ett effektivt sätt för att undersöka förändringar i genuttryck i matstrupen epitel som svar på refluxate komponenter 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta manuskript beskriver produktion och karaktärisering av en biologiskt relevanta humana matstrupen mucosal modell som lämpar sig för användning som en experimentell plattform för att studera effekterna av exponering för miljöpåverkande faktorer på matstrupen epitel.
De mest kritiska stegen för en framgångsrik produktion av en mänsklig matstrupen mucosal modellen: att se till att majoriteten av de epitelceller förblir proliferativ och inte redan har börjat differentiera för…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi är tacksamma mot Roger Ackroyd, Andrew Wyman och Chris Stoddard, konsult Kirurg Sheffield universitetssjukhus NHS Foundation Trust, för deras hjälp med att skaffa esofagus vävnadsprover och sitt stöd för vårt arbete. Vi tackar Ashraful Haque för hans hjälp som innehåller tumörcellinjer i modellen. Vi erkänner tacksamt finansiellt stöd för denna studie med bidrag från Bardhan Forskning och utbildning Trust (BRET) och Yorkshire cancerforskning (YCR).
Materials
| Trypsin | BD Biosciences | 215240 | Prepare 0.1% w/v solution in PBS and filter sterilise. Warm in 37°C water bath before use |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | Warm in 37°C water bath before use |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | Warm in 37°C water bath before use |
| Foetal Calf Serum | Labtech | FB-1090 | |
| Epidermal Growth Factor | R+D Systems | 236-EG-200 | Prepare 200 µg/ml stock solution in 10 mM acetic acid, 1% FCS |
| Hydorcortisone | Sigma-Aldrich | H0396 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Adenine | Sigma-Aldrich | A2786 | Prepare stock solution in PBS and filter sterilise before use |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I2767 | Prepare 10 mg/ml solution in 0.01M HCl, dilute 1:10 in distilled water and filter sterilise before use |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | T2036 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Triiodothyronine | Sigma-Aldrich | T2752 | Prepare stock solution in distilled water and filter sterilise before use |
| Cholera toxin | Sigma-Aldrich | C8052 | Prepare stock solution in water |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| Amphotericin B | Gibco | 15290-026 | Brand name Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | Dissolve 1 tablet in 100 ml water and autoclave to sterilise |
| Collagenase A | Roche | 10103578001 | |
| Povidone-iodine solution | Ecolab | 10830E | Brand name Videne |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 433209 | Prepare 1M solution and autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G2025 | Autoclave to sterilise before use (121 ˚C for 15 min) |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| Newborn calf serum | Gibco | 26010074 | |
| Progesterone | Sigma-Aldrich | P8783 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use use |
| O-phosphorylethanolamine | Sigma-Aldrich | P0503 | Prepare stock solution in DMEM and filter sterilise before use |
| ITS (insulin, transferrin, selenium) | Lonza | 17-838Z | Used for composite media preparation |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | Warm in 37°C water bath before use |
| EDTA 0.02% solution | Sigma-Aldrich | E8008 | Warm in 37°C water bath before use |
| T75 culture flask | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml centrifuge tube | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml universal tube | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml pot | VWR | 216-2603 | |
| Petri dish | SLS | 150350 | |
| 6 well plate | VWR | 734-2323 | |
| stainless steel rings | Manufactured in house – medical grade stainless steel, internal diameter 10 mm, external diameter 20 mm | ||
| steel mesh grids | Manufactured in house – sheets have 0.3 cm diameter holes, bent to produce grid 2cm (w) x2 cm (d) x 0.5 cm (h) | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | Clone MM1 Use at 1:100 |
| CK4 | Abcam | ab9004 | Clone 6B10 Use at 1:200 |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | Clone LL002 Use at 1:200 |
| Involucrin | Novocastra | INV | Clone SY5 Use at 1:100 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| Mouse 3T3 fibroblasts | ATCC-LGC | CRL-1658 | previously growth arrested by irradiation (60 Gy) |
References
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
- Andl, C. D., et al. Epidermal growth factor receptor mediates increased cell proliferation, migration, and aggregation in esophageal keratinocytes in vitro and in vivo. J. Biol. Chem. 278 (3), 1824-1830 (2003).
- Underwood, T. J., et al. A comparison of primary oesophageal squamous epithelial cells with HET-1A in organotypic culture. Biol. Cell. 102 (12), 635-644 (2010).
- Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. J. Pathol. 205 (4), 468-475 (2005).
- Okawa, T., et al. The functional interplay between EGFR overexpression, hTERT activation, and p53 mutation in esophageal epithelial cells with activation of stromal fibroblasts induces tumor development, invasion, and differentiation. Genes & Development. 21 (21), 2788-2803 (2007).
- Green, N., et al. The development and characterization of an organotypic tissue-engineered human esophageal mucosal model. Tissue Eng Part A. 16 (3), 1053-1064 (2010).
- Harada, H., et al. Telomerase induces immortalization of human esophageal keratinocytes without p16INK4a inactivation. Mol. Cancer Res. 1 (10), 729-738 (2003).
- Bhargava, S., Chapple, C. R., Bullock, A. J., Layton, C., MacNeil, S. Tissue-engineered buccal mucosa for substitution urethroplasty. BJU. Int. 93 (6), 807-811 (2004).
- Ralston, D. R., et al. Keratinocytes contract human dermal extracellular matrix and reduce soluble fibronectin production by fibroblasts in a skin composite model. Br. J. Plast. Surg. 50 (6), 408-415 (1997).
- Green, N. H., et al. Pulsatile exposure to simulated reflux leads to changes in gene expression in a 3D model of oesophageal mucosa. Int. J. Exp. Pathol. 95 (3), 216-228 (2014).
- Wang, C. S., et al. Selective culture of epithelial cells from primary breast carcinomas using irradiated 3T3 cells as feeder layer. Pathol. Res. Pract. 197 (3), 175-181 (2001).
- Ricardo, R., Phelan, K. Trypsinizing and subculturing mammalian cells. J. Vis. Exp. (16), e755 (2008).
- . Using a Hemacytometer to Count Cells. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. , (2014).
- Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. N. Am. J. Med. Sci. 4 (9), 429-434 (2012).
- Streit, S., Michalski, C. W., Erkan, M., Kleeff, J., Friess, H. Northern blot analysis for detection and quantification of RNA in pancreatic cancer cells and tissues. Nat. Protoc. 4 (1), 37-43 (2009).
- Morgan, E., et al. Cytometric bead array: a multiplexed assay platform with applications in various areas of biology. Clin. Immunol. 110 (3), 252-266 (2004).
- Xu, M., et al. The abnormal expression of retinoic acid receptor-beta, p 53 and Ki67 protein in normal, premalignant and malignant esophageal tissues. World J. Gastroenterol. 8 (2), 200-202 (2002).
- Moll, R., Divo, M., Langbein, L. The human keratins: biology and pathology. Histochem. Cell Biol. 129 (6), 705-733 (2008).
- Rice, R. H., Green, H. Presence in human epidermal cells of a soluble protein precursor of the cross-linked envelope: activation of the cross-linking by calcium ions. Cell. 18 (3), 681-694 (1979).
- Eves, P., et al. Melanoma invasion in reconstructed human skin is influenced by skin cells – investigation of the role of proteolytic enzymes. Clin. Exp. Metastasis. 20 (8), 685-700 (2003).
