Immunokleuring om Murine Enteric Nervous System Development Visualiseer
Summary
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Neural crest cells differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Abstract
The enteric nervous system is formed by neural crest cells that proliferate, migrate and colonize the gut. Following colonization, neural crest cells must then differentiate into neurons with markers specific for their neurotransmitter phenotype. Cholinergic neurons, a major neurotransmitter phenotype in the enteric nervous system, are identified by staining for choline acetyltransferase (ChAT), the synthesizing enzyme for acetylcholine. Historical efforts to visualize cholinergic neurons have been hampered by antibodies with differing specificities to central nervous system versus peripheral nervous system ChAT. We and others have overcome this limitation by using an antibody against placental ChAT, which recognizes both central and peripheral ChAT, to successfully visualize embryonic enteric cholinergic neurons. Additionally, we have compared this antibody to genetic reporters for ChAT and shown that the antibody is more reliable during embryogenesis. This protocol describes a technique for dissecting, fixing and immunostaining of the murine embryonic gastrointestinal tract to visualize enteric nervous system neurotransmitter expression.
Introduction
Een functionerende enterisch zenuwstelsel (ENS), die de beweeglijkheid, de opname van voedingsstoffen, en de lokale doorbloeding controleert, is essentieel voor het leven 1. De ENS wordt gevormd door neurale cellen (NCC) die prolifereren, te migreren en koloniseren de darm, waar ze differentiëren tot ganglia neuronen en gliacellen. De ziekte van Hirschsprung (HSCR, Online Mendelian Inheritance in Man), een multigeneic aangeboren aandoening met een incidentie van 1 op 4000 levendgeborenen, kan worden beschouwd als de prototypische ziekte voor het bestuderen verstoord ENS formatie. In HSCR, NCC niet te migreren en koloniseren verschillende lengten van de distale dikke darm 2. Bovendien, andere veel voorkomende gastro-intestinale (GI) ontwikkelingsstoornissen gebreken in de pediatrische populatie, zoals anorectal misvormingen, intestinale atresias en motiliteitsstoornissen gepaard gaan met stoornissen in de basis ENS functies, en zijn waarschijnlijk geassocieerd met subtiele, ondergewaardeerde, anatomische veranderingen en functionele veranderingen inde ENS 3-6. Daarom kan technieken die ons toelaten om de ontwikkeling determinanten van ENS vorming begrijpen licht werpen op het ontstaan en de mogelijke behandeling van pediatrische maagdarmstelsel aandoeningen.
Na migratie en kolonisatie, NCC differentieert in neuronen met markers die specifiek zijn voor hun neurotransmitter fenotype. Cholinergische neuronen omvatten ongeveer 60% van enterische neuronen 7 en kan worden gedetecteerd door kleuring choline acetyltransferase (ChAT), het enzym synthetiserende de excitatoire neurotransmitter acetylcholine. Historisch gezien, probeert visualiseren cholinerge neuronen veroorzaakt werden door verschillende antigeenspecificiteit van antilichamen gericht tegen het centrale zenuwstelsel (CNS) ChAT versus perifere zenuwstelsel (PNS) ChAT 8-10. Echter, antilichamen gericht tegen ChAT placenta herkennen zowel de centrale en perifere ChAT 11-13, en we hebben onlangs beschreven technieken die het mogelijk maken voor Visuabiliseren van ENS cholinergische neuronen met een hoge gevoeligheid eerder in ontwikkeling dan is bereikt met ChAT reporter lijnen 14.
Hier presenteren we een techniek voor het ontleden, fixeren en immunokleuring van het murine embryonale spijsverteringskanaal aan ENS neurotransmitter expressie in neuronen te visualiseren. FloxSTOP:: tdTomato dieren produceren Chat Cre; R26R: Voor deze studies hebben we ChAT-Cre muizen gekruist met R26R benut floxSTOP: tdTomato muizen (gedefinieerd als ChAT-Cre tdTomato het hele manuscript). Deze dieren werden vervolgens gekruist met homozygote ChAT-GFP reporter muizen, muizen die zowel fluorescerende verslaggevers dat ChAT expressie 14 te detecteren verkrijgen. Deze twee reporter dieren zijn op een C57BL / 6J achtergrond en zijn commercieel verkrijgbaar (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ons laboratorium en anderen hebben aangetoond dat intestinale afwijkingen in HSCR niet worden beperkt tot de aganglionic colon maar proximaal uitgebreid, zelfs tot in de ganglionated dunne darm 5,15,16. Deze veranderingen omvatten veranderingen in ENS neuronale dichtheid en neurotransmitter fenotype en kan goed zijn voor dysmotiliteit die is waargenomen bij patiënten met HSCR. We hebben de bovenstaande technieken gebruikt in onze inspanningen om de determinanten van ENS formatie te begrijpen. Specifiek zijn …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund byThe American Pediatric Surgical Association Foundation Award (AG) en de National Institutes of Health K08DK098271 (AG).
Materials
| Phosphate Buffered Saline | Oxoid | BR0014G | |
| Sucrose | Fisher | S2 | |
| Sodium Azide | Fisher | BP9221 | |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP1605 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| 60 mm Petri dishes | Fisher | FB0875713A | |
| Fluorescence scope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| Fine forceps | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| Glass slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Cover glass | VWR | 16004-330 | |
| Confocal microscope | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
References
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
- Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
- Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
- Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung’s disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
- Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
- Qu, Z. -. D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
- Bian, X. -. C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
- Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
- Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
- Koga, T., Bellier, J. -. P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
- Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
- Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
- Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
- Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung’s-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
- Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung’s disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
- Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).
