Xenopus laevis como um modelo para identificar Tradução Impairment
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
A síntese de proteínas é um processo fundamental para a expressão do gene impactando processos biológicos diversos, nomeadamente de adaptação a condições ambientais. A etapa de iniciação, que envolve a montagem das subunidades ribossomais no mRNA codão de iniciação, fator de iniciação envolvidos, incluindo eIF4G1. Defeitos neste passo limitante da taxa de tradução estão ligados a diversos distúrbios. Para estudar as consequências potenciais de tais desregulamentações, oócitos de Xenopus laevis constituem um modelo atraente com um alto grau de conservação dos mecanismos celulares e moleculares essenciais com humano. Além disso, durante a maturação meiótica, os oócitos são transcriptionally reprimida e todas as proteínas necessárias são traduzidos do pré-existentes, mRNAs maternos. Este modelo de baixo custo permite mRNA exógena para tornar-se perfeitamente integrado com uma tradução eficaz. Aqui é descrito um protocolo para avaliação de tradução com um fator de interesse (aqui eIF4G1) usando stored ARNm materno que são as primeiras a ser traduzido poliadenilado e durante a maturação do oócito como uma leitura fisiológico. Em primeiro lugar, o ARNm sintetizado por transcrição in vitro de plasmídeos de interesse (aqui eIF4G1) são injectados em oócitos e cinética de maturação dos oócitos por detecção de ruptura da vesícula germinal está determinada. O alvo de ARNm materno estudado é a serina / treonina-proteína MOS-quinase. Sua poliadenilação e sua subsequente tradução são investigados juntamente com a expressão e fosforilação de proteínas das mos cascata de sinalização envolvidos na maturação do oócito. Variações do protocolo atual de apresentar defeitos translacionais também são propostos para enfatizar a sua aplicabilidade geral. À luz da evidência de que a síntese de proteína aberrante pode estar envolvido na patogénese de desordens neurológicas emergente, um tal modelo proporciona a oportunidade de avaliar facilmente essa deficiência e identificar novos alvos.
Introduction
As proteínas são elementos essenciais da vida celular e, portanto, em maior escala do organismo. Eles garantem a maioria das funções celulares, incluindo a estrutura, o transporte, a catálise da reacção, a regulação, a expressão do gene, etc. A expressão é o resultado de um complexo mecanismo de tradução permitindo a conversão de um ARNm em proteína. A tradução é submetido a vários controlos para adaptar e para regular a expressão de genes de acordo com as necessidades das células, durante o desenvolvimento e a diferenciação, envelhecimento, stress fisiológico ou manifestações patológicas.
A tradução é dividido em 3 fases (iniciação, alongamento e terminação) e apresenta 3 sistemas de tradução de iniciação, a fim de responder a essas necessidades: dependente da tampa, independente-cap via Segmento Ribossomo Entrada interno (IRES) Estruturas e realçadores de tradução cap-Independent ( CITE).
A maioria dos mRNA eucarióticas são traduzidos em um tampão-Dependent maneira através da tampa de 5'-trifosfato de 7-metilguanosina, que serve como uma função de reconhecimento, durante a síntese de proteínas. Este tampão liga-se a eIF4E, um componente do complexo eIF4F com eIF4G1 e eIF4A. Associado com outros parceiros como poli (A) Binding Protein (PABP), eIF2 GTP-Met-Met-ARNt, estes factores de iniciação da tradução do mRNA permitir a circularizar e melhorar a sua acessibilidade para as formas 43S complexo de iniciação até que o codão AUG reconhecimento 1. Este caso corresponde ao fim da iniciação da tradução ou seja, o primeiro passo de tradução.
Tradução independente de Cap é usado por codificação de mRNA para as proteínas essenciais em condições de tensão que induzem para a proliferação celular e apoptose instância. Este mecanismo envolve estruturas secundárias no ARNm 5'-região não traduzida (UTR) chamado IRES, a extremidade carboxi-terminal de eIF4G1 associado com o complexo eIF4A e 43S. A ligação deste 43S pré-iniciação complex para IRES inicia a tradução tampão independente, sem a necessidade de um factor de 2,3 eIF4E.
Por fim, outro mecanismo de tradução ainda não é bem compreendida suporta esta atividade tradução independente-tampão em condições de tensão via CITE estruturas localizadas dentro de mRNA UTR 4.
Através destes diferentes modos de tradução que diferem em suas etapas de iniciação, tradução desempenha um papel crítico na homeostase celular e alterações em qualquer um destes processos, assim, teria impacto do organismo com pequena para efeitos de grande escala. Na verdade, o início é um passo limitante da taxa que rege os processos de tradução corretas de mRNA em proteínas e é, portanto, alvo de inúmeros controles e pontos de regulação 5. Se é para o último ou para os componentes desses processos, se acaba por ser defeituoso, ele vai perturbar o equilíbrio estabelecido na célula e, portanto, poderia levar a condi patológicações. Neste contexto, as mutações em fatores de conversão ter sido envolvido em várias doenças, incluindo doenças neurodegenerativas, tais como `Leucoencefalopatia com desaparecer matter' branco (eIF2B1-5 subunidade) 6, na síndrome de Walcott-Rallison (gene que codifica para EIF2AK3 PERK) 7, potencialmente doença (eIF4G1 p.R1205H) de Parkinson 8. Por conseguinte, é importante a realização de estudos celulares e moleculares destas proteínas mutantes para aumentar o nosso conhecimento sobre o desenvolvimento da doença e em geral o processo de iniciação da tradução.
Para realizar esses estudos, é essencial para escolher os modelos mais adequados para observar as consequências dessas mutações oócitos de Xenopus laevis são particularmente bem adaptado devido às suas propriedades fisiológicas e bioquímicas:. Sincronicidade fisiológica (bloqueado na fase G2 do ciclo celular) , elevada capacidade de síntese de proteína (200-400 ng / dia / oócito), elevado número de OOC extraídaytes a partir de um mesmo animal (800-1.000 oócitos / feminino) e o tamanho das células (1,2-1,4 mm de diâmetro), o que facilita a sua manipulação. A microinjecção de oócitos de Xenopus com ARNm sintetizado pode ser facilmente realizada para dissecar passos de tradução. Neste ponto de vista, apresenta outras vantagens. Dada a velocidade de progressão da meiose e da tradução do mRNA após microinjecção (~ 24 h), oócito de Xenopus representa um sistema rápido em comparação com os sistemas celulares reconstituídos (extraído de E. coli, germes de trigo ou de reticulócitos de coelho …) em que um ARNm é traduzida com uma taxa de tradução reduzida e a uma velocidade mais baixa. Assim, os efeitos de uma mutação introduzida em um ARNm irá ser rapidamente e facilmente observável estudada em vários ovócitos. Outra vantagem de oócitos de Xenopus é que mRNAs maternas são latentes e tradução da proteína é bloqueada antes da estimulação progesterona. A adição de progesterona é, portanto, um bom meio de controlar a indução de tradução. Citoplasmática pO olyadenylation não ocorrer durante a oogenese. Inicia-se durante a maturação de oócitos em oócitos de progesterona estimulada por em uma ordem temporal e continua durante todo o desenvolvimento precoce e pode ser usado para estudar as diferentes etapas de tradução.
A poliadenilação do mRNA é mos entre os primeiros a ocorrer e que pertence Aurora com A / EG2, Histone-Like B4 mRNA para a classe de genes "de maturação precoce", definidas na Charlesworth et al. (2004) 9. A indução da tradução do mRNA "final", como ciclina A1 e B1 Cyclin ocorre em torno do tempo de rompimento da vesícula germinativa (GVBD). Mos ARNm codifica uma cinase serina / treonina-proteína. Sua tradução é crucial, uma vez que induz a quinase MAP cascata que indiretamente ativa a maturação do oócito. Com efeito, em resposta à progesterona, poliadenilação do ARNm MOS é reforçada através de um processo que envolve Aurora A / EG2 proteínas reguladoras e outras proteínas de ligação de ARN com the 3? UTR do mRNA de MOS. Este aumento de poliadenilação do ARNm MOS leva a um aumento do nível de proteína MOS, que por sua vez activa MEK1. Este processo medeia a activação da sinalização extracelular regulada-quinase 2 (ERK2) (Figura 1). Esta cascata de sinalização pode então provocar o M-fase de maturação promover factores, um complexo formado pela ciclina B e cdc2-quinase, e, eventualmente, resulta no recomeço da meiose.
Portanto, em oócitos de Xenopus laevis, o estudo de ARNm maternais como MOS pode ser facilmente utilizado para testar a sua possibilidade de tradução com vários parâmetros da sua poliadenilação eficiente para a tradução de vários componentes MOS de sinalização, incluindo também a determinação da taxa de GVBD. Este sistema é, portanto, interessante para avaliar as primeiras conseqüências de mutações nos fatores de iniciação da tradução, sem interferência do mRNA recentemente transcrito ou de eficiência de transfecção, os problemas que ocorrem frequentemente com eukaryestudos com células óticas.
Aqui, um protocolo é estabelecido onde mRNAs eIF4G1 mutantes são microinjeção em oócitos de Xenopus laevis ea tradução do mRNA materno é testada. Na presença de um defeito na progressão GVBD, mos de poliadenilação do ARNm que é essencial para a progressão através do ciclo celular meiótica dos oócitos e para o subsequente tradução de mRNAs precoces e tardios classe é verificada. A fosforilação Aurora A / EG2 e ERK também é estudada para confirmar a consequência da mos deregulation.Thus, oócitos de Xenopus representam uma forma simples de analisar diferentes etapas de tradução do mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
A tradução é um mecanismo envolvido na fisiopatologia de numerosas doenças humanas, incluindo várias doenças neurodegenerativas. Por exemplo, na doença de Parkinson vários relatórios sugeriram o comprometimento em tradução associada a mutações hereditárias 8,12,13.
Vários modelos celulares estão disponíveis para estudar a tradução. Aqui, a fim de estudar as consequências de translação de uma mutação em eIF4G1 que actua como dominante negativo mutação redu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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