القيطم المورق نموذجا لتحديد الترجمة انخفاض قيمة
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
تخليق البروتين هو عملية أساسية في التعبير الجيني يؤثر العمليات البيولوجية المختلفة وخاصة التكيف مع الظروف البيئية. الخطوة بدء، الذي ينطوي على تجميع مفارز الريباسي في مرنا بدء كودون، تشارك عامل الشروع بما في ذلك eIF4G1. ترتبط عيوب في هذا معدل الحد خطوة من الترجمة إلى اضطرابات متنوعة. لدراسة العواقب المحتملة لمثل هذه deregulations، القيطم المورق البويضات تشكل نموذجا جذابا مع درجة عالية من الحفاظ على الآليات الخلوية والجزيئية الأساسية مع الإنسان. بالإضافة إلى ذلك، أثناء النضج الانتصافي، وقمع transcriptionally البويضات ويتم تحويل جميع البروتينات اللازمة من قبل الايجاد، من mRNAs المستمدة أمومي. هذا النموذج غير مكلفة يمكن مرنا خارجي لتصبح متكاملة تماما مع ترجمة فعالة. هنا يوصف بروتوكول لتقييم الترجمة مع عامل الفائدة (هنا eIF4G1) باستخدام ستورإد مرنا الأمهات التي هي أول من مذيل بعديد الأدينيلات وترجمتها خلال نضوج البويضة كما قراءات الفسيولوجية. في البداية، مرنا synthetized من قبل في المختبر النسخ من البلازميدات الفائدة (هنا eIF4G1) يتم حقنها في البويضات وحركية نضوج البويضة بواسطة جرمينال الحويصلة كشف انهيار يتحدد. ودرس الهدف مرنا الأمهات سيرين / موس ثريونين البروتين كيناز. يتم التحقيق في تذييل بعديد الأدينيلات وترجمتها لاحقا إلى جانب التعبير والفسفرة من بروتينات موس يشير التعاقبي المشاركة في نضوج البويضة. الاختلافات في البروتوكول الحالي لطرح ويقترح العيوب متعدية أيضا التأكيد على انطباق العام لها. في ضوء الأدلة التي تخليق البروتين الشاذة قد تكون لهم علاقة في التسبب في اضطرابات العصبية الناشئة، ويوفر هذا النموذج فرصة لتقييم بسهولة هذا الانخفاض وتحديد أهداف جديدة.
Introduction
البروتينات هي العناصر الأساسية للحياة الخلوية وبالتالي في نطاق أكبر من الكائن الحي. وتضمن الجزء الأكبر من الوظائف الخلوية بما في ذلك الهيكل، والنقل، والحفز رد فعل، والتنظيم، التعبير الجيني الخ التعبير عنها هو نتيجة لآلية معقدة للترجمة السماح للتحويل من مرنا في البروتين. يخضع ترجمة لضوابط مختلفة للتكيف وتنظيم التعبير الجيني وفقا لاحتياجات الخلية، أثناء التطور والتمايز، والشيخوخة، والضغوط النفسية أو المظاهر المرضية.
وتنقسم الترجمة إلى 3 مراحل (بدء، واستطالة وإنهاء) ويعرض 3 أنظمة الترجمة بدء من أجل الاستجابة لهذه الاحتياجات: تعتمد على كأب، وقبعة مستقل عبر القطاعية دخول الريبوسوم الداخلية (IRES) الهياكل ومعززات ترجمة الحد الأقصى المستقلة ( CITE).
ويتم تحويل معظم مرنا حقيقية النواة في سقف DEPEndent الطريقة عبر 7-methylguanosine سقف 5'-ثلاثي الفوسفات التي هي بمثابة ميزة التعرف خلال تخليق البروتين. هذا الغطاء بربط eIF4E، وهو مكون من مجمع eIF4F مع eIF4G1 وeIF4A. يرتبط مع شركاء آخرين مثل بولي (A) بروتين (PABP)، eIF2-GTP-MET-الحمض الريبي النووي النقال الأرصاد الجوية، هذه العوامل ترجمة بدء تسمح لالتعميم مرنا وتحسين إمكانية الوصول إلى أشكال 43S معقدة حتى بدء أغسطس كودون الاعتراف 1. هذا الحدث يناظر نهاية أي ترجمة بدء، فإن الخطوة الأولى من الترجمة.
يستخدم ترجمة الحد الأقصى المستقل ترميز مرنا لالبروتينات الضرورية في ظل ظروف أكد أن تحفز لتكاثر الخلايا المثال وموت الخلايا المبرمج. وتنطوي هذه الآلية الهياكل الثانوية في مرنا 5'- المنطقة غير المترجمة (UTR) دعا IRES، ونهاية كربوكسي محطة من eIF4G1 المرتبطة eIF4A ومجمع 43S. الربط هذا 43S قبل الشروع جomplex إلى IRES يبدأ الترجمة سقف مستقلة دون الحاجة إلى eIF4E عامل 2،3.
وأخيرا، آلية ترجمة أخرى لا تزال غير مفهومة جيدا تدعم هذا النشاط ترجمة الحد الأقصى مستقل في ظل ظروف وشدد عبر CITE الهياكل التي تقع داخل مرنا UTR 4.
من خلال هذه الأنماط المختلفة للترجمة اختلاف خطوات البدء فيها، والترجمة تلعب دورا حاسما في توازن الخلايا وأي تغيير في واحدة من هذه العمليات وبذلك تؤثر على الكائن الحي مع الصغيرة لتأثيرات واسعة النطاق. في الواقع، والشروع خطوة معدل الحد الذي يحكم عمليات الترجمة الصحيحة من مرنا في البروتينات وبالتالي فهو هدفا للعديد من الضوابط ونقاط المادة 5. ما إذا كان لهذا الأخير أو لمكونات هذه العمليات، إذا كان أحد اتضح أن تكون معيبة، وسوف التشويش على التوازن القائم في الخلية، وبالتالي يمكن أن تؤدي إلى كوندي مرضيةستعقد. في هذا السياق، وقد شاركت طفرات في عوامل الترجمة في العديد من الاضطرابات بما في ذلك الاضطرابات العصبية مثل `اعتلال بيضاء الدماغ مع التلاشي matter' الأبيض (eIF2B1-5 فرعية) 6، في متلازمة والكوت-Rallison (ترميز الجين EIF2AK3 لرفع معنوياته) 7، وربما في مرض (eIF4G1 p.R1205H) باركنسون 8. ولذلك فمن المهم إجراء الدراسات الخلوية والجزيئية لهذه البروتينات متحولة إلى زيادة معرفتنا على تطور المرض وعلى العملية العامة لترجمة المبادرة.
لتنفيذ هذه الدراسات، فمن الضروري اختيار النماذج الأكثر ملائمة لمراقبة آثار هذه الطفرات القيطم المورق تتكيف البويضات بشكل خاص نظرا لخصائصها الفسيولوجية والبيوكيميائية: التزامن الفسيولوجية (سدت في المرحلة G2 من دورة الخلية) ، قدرة عالية من تخليق البروتين (200-400 نانوغرام / اليوم / البويضة)، وعدد كبير من شركة النفط العمانية المستخرجytes من نفس الحيوان (800-1،000 البويضات / أنثى) وحجم الخلية (1،2-1،4 مم في القطر) مما يسهل التلاعب بهم. Microinjection من البويضات القيطم مع تصنيعه مرنا يمكن بسهولة أن يؤديها لتشريح الخطوات الترجمة. في هذا الرأي أنه يقدم مزايا أخرى. ونظرا لسرعة الانقسام الاختزالي التقدم والترجمة مرنا بعد microinjection (~ 24 ساعة)، وتمثل القيطم البويضة نظام سريع مقارنة بأنظمة أعيد الخلوية (المستخرج من القولونية والجراثيم القمح أو الأرانب الخلايا الشبكية …) التي مرنا هو ترجم بمعدل ترجمة خفض وبسرعة أقل. لذلك، فإن آثار الطفرة التي أدخلت في مرنا يكون سريعا ملاحظتها ودراستها بسهولة في العديد من البويضات. ميزة أخرى من البويضات القيطم هي أن من mRNAs الأمهات الكامنة ومنعت ترجمة البروتين قبل التحفيز البروجسترون. إضافة البروجسترون هو بالتالي وسيلة جيدة للتحكم في الحث الترجمة. ص حشويةolyadenylation لا تحدث أثناء oogenesis. وهي تبدأ خلال نضوج البويضة في البويضات حفز البروجسترون في النظام الزمني وتستمر طوال التنمية في وقت مبكر، ويمكن استخدامها لدراسة الخطوات المختلفة للترجمة.
وتذييل بعديد الأدينيلات من موس مرنا هو من بين أول من تحدث وأنه ينتمي مع أورورا A / EG2، هيستون، مثل B4 مرنا لفئة من الجينات "النضج المبكر" على النحو المحدد في تشارلزورث وآخرون (2004) 9. تحريض متعدية مرنا "المتأخرة" مثل السيكلين A1 و B1 السيكلين يحدث في وقت قريب من انهيار حويصلة جرثومي (GVBD). موس مرنا يشفر كيناز سيرين / ثريونين البروتين. ترجمته أمر بالغ الأهمية لأنه يحرض على MAP كيناز شلال الذي ينشط بشكل غير مباشر على نضوج البويضة. في الواقع، في استجابة لهرمون البروجسترون، مما يعزز تذييل بعديد الأدينيلات من موس مرنا خلال عملية تنطوي أورورا A / EG2 البروتينات التنظيمية وغيرها من RNA ملزم البروتينات مع الالبريد 3'UTR من موس مرنا. هذا تذييل بعديد الأدينيلات زيادة موس مرنا يؤدي إلى زيادة مستوى البروتين موس، والذي بدوره ينشط MEK1. هذه العملية تتوسط تفعيل الخلية التي تنظمها إشارات كيناز 2 (ERK2) (الشكل 1). وهذا يمكن أن يشير إلى سلسلة ثم تؤدي إلى نضوج M-مرحلة تعزيز العوامل، مجمع شكلتها السيكلين B وCdc2 كيناز، والنتائج في نهاية المطاف في استئناف الانتصافي.
لذلك في القيطم المورق البويضات، يمكن بسهولة أن تستخدم دراسة مرنا الأمهات مثل موس لاختبار ترجمتها مع عدة نقاط النهاية من تذييل بعديد الأدينيلات بكفاءة لترجمة عدة موس يشير مكونات، بما في ذلك أيضا تحديد معدل GVBD. هذا النظام هو بالتالي مثيرة للاهتمام لتقييم النتائج الأولى للطفرات في عوامل ترجمة الشروع دون تدخل من كتب حديثا مرنا أو الكفاءة ترنسفكأيشن، المشاكل التي تحدث في كثير من الأحيان مع eukaryدراسات الخلايا أذني.
هنا، يتم إنشاء بروتوكول حيث يتم microinjected من mRNAs eIF4G1 متحولة في القيطم المورق البويضات ويتم اختبار الترجمة مرنا الأمهات. في وجود عيب في GVBD التقدم، موس مرنا تذييل بعديد الأدينيلات وهو أمر ضروري للتقدم من خلال دورة الخلية الانتصافي بويضة وللترجمة اللاحقة من mRNAs الدرجة المبكرة والمتأخرة يتم التأكد. ودرس الفسفرة أورورا A / EG2 وERK أيضا لتأكيد نتيجة لموس deregulation.Thus، البويضات القيطم تمثل وسيلة بسيطة لتحليل الخطوات المختلفة الترجمة مرنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الترجمة هي آلية المشاركة في الفيزيوباثيا العديد من الاضطرابات الإنسان بما في ذلك العديد من الأمراض العصبية. على سبيل المثال في مرض باركنسون اقترحت عدة تقارير ضعف في الترجمة المرتبطة بطفرات وراثية 8،12،13.
تتوفر لدراسة ترجمة …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
