アフリカツメガエルは、翻訳減損を識別するためのモデルとして、 アフリカツメガエル
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
タンパク質合成は、多様な生物学的プロセスに影響を与える遺伝子発現環境条件に特に適応への基本的なプロセスです。 mRNAの開始コドン、eIF4G1含む関与の開始因子でリボソームサブユニットの組み立てを伴う開始段階、。翻訳のこの律速段階の欠陥は、多様な疾患にリンクされています。そのような規制緩和の潜在的な影響を検討するために、 アフリカツメガエル卵母細胞が、ヒトとの本質的な細胞および分子メカニズムの保全度の高い魅力的なモデルを構成しているアフリカツメガエル 。また、減数分裂成熟中に、卵母細胞は、転写抑制され、すべての必要なタンパク質は、既存の、母体由来のmRNAから翻訳されます。この安価なモデルは、効果的な翻訳と完全に統合になるために、外因性のmRNAを可能にします。ここではSTORを使用して（ここではeIF4G1）興味の率で翻訳を評価するためのプロトコルに記載されています生理的な読み出しとして、卵母細胞の成熟中にポリアデニル化および翻訳することが最初のものである母性mRNAのエド。最初に、関心のプラスミドのインビトロ転写（ここeIF4G1）によって合成さmRNAは卵核胞崩壊検出が決定されることにより、卵母細胞および卵成熟の速度で注入されます。研究母性mRNA標的は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼモスです。そのポリアデニル化およびその後の翻訳は、卵母細胞の成熟に関与するシグナル伝達カスケードMOSのタンパク質の発現およびリン酸化と一緒に検討しています。現在のプロトコルのバリエーションが提唱する翻訳の欠陥は、その一般的な適用性を強調するために提案されています。異常なタンパク質合成は、神経疾患の病因に関与し得ることを新たな証拠に照らして、そのようなモデルは、簡単にこの障害を評価し、新たな標的を同定するための機会を提供します。
Introduction
タンパク質は、細胞の生命の本質的な要素であり、したがって、生物の大規模で。彼らは、それらの発現はmRNAのタンパク質への変換を可能にする翻訳の複雑な機構の結果であるなど構造、輸送、反応触媒、規制、遺伝子発現を含む細胞機能の大部分を確保します。翻訳に適応するために、開発および分化、老化、生理学的ストレスまたは病理学的徴候の間、細胞の必要に応じて遺伝子発現を調節するために様々な制御に供されます。
キャップ依存性、キャップ非依存の内部リボソーム侵入セグメント（IRES）の構造とキャップ非依存性翻訳エンハンサー（ 経由 ：翻訳は、3開始翻訳システムこれらのニーズに対応するために3段階（開始、伸長及び終了）やプレゼントに分割され、 ）CITE。
ほとんどの真核生物のmRNAはキャップDEPEに翻訳されていますタンパク質合成の間に認識機能として機能7-メチル5'-三リン酸キャップ経由 ndentの方法。このキャップは、eIF4Eの、eIF4G1とeIF4AとeIF4F複合体の成分に結合します。ポリ（A）結合タンパク質（PABP）のような他のパートナーに関連する、EIF2-GTP-Metの-tRNAのMetは 、これらの翻訳開始因子は、mRNAを環状と認識1 AUG開始コドンまで、フォームに43S複合体をそのアクセス性を向上させることができます。このイベントは、翻訳開始、すなわち、翻訳の最初のステップの終わりに相当します。
キャップ非依存性翻訳は、例えば細胞増殖およびアポトーシスのために誘導するストレスの条件下で必須タンパク質をコードするmRNAによって使用されます。このメカニズムは、mRNA中の二次構造を伴う5'-非翻訳領域（UTR）はIRES、eIF4Aおよび43S複合体と会合しeIF4G1のカルボキシ末端と呼ばれます。この43S開始前Cの結合IRESにomplexは、eIF4Eの係数2,3を必要とせずにキャップ依存性翻訳を開始します。
mRNAのUTR 4内に配置された構造をCITE を経由して最後に、まだよくわかっていない別の変換メカニズムは、ストレス条件下では、このキャップ非依存性翻訳活性をサポートしています。
彼らの開始段階によって異なる翻訳のこれらの様々なモードを通じ、翻訳が細胞の恒常性に重要な役割を果たし、これらのプロセスのいずれかの変化は、このように大規模な効果のために小さなと生物に影響を与えるだろう。実際、開始は、タンパク質へのmRNAの正しい翻訳プロセスを支配する律速段階であるため、多数のコントロールの対象と規制点5です。一つは欠陥があることが判明した場合、それは後者のために、またはこれらのプロセスのコンポーネントのためのものであるかどうか、それが細胞内で確立されたバランスを乱すますので、病理学的コンディにつながる可能性ション。この文脈では、翻訳因子における変異は、潜在的に、ウォルコット-Rallison症候群（PERK用EIF2AK3をコードする遺伝子）7に 、白matter'（eIF2B1-5サブユニット）6を消失して、そのような`巣性白質脳症などの神経変性疾患を含むいくつかの疾患に関与してきましたパーキンソン病（eIF4G1のp.R1205H）8。それは、疾患の開発に、翻訳開始の一般的な方法で知識を高めるために、これらの変異体タンパク質の細胞および分子の試験を実施することが重要です。
これらの研究を行うためには、これらの変異の影響を観察するための最も適切なモデルを選択することが重要であるアフリカツメガエルの卵母細胞は、特によく、それらの生理学的および生化学的性質に適合されているアフリカツメガエル ：（細胞周期の位相G2にブロックされた）生理的な同期タンパク質合成の、大容量（200〜400 ngの/日/卵母細胞）、抽出されたOOCの数が多いです同じ動物からytes（800〜卵母細胞/女性）と、その操作を容易に細胞の大きさ（直径1.2〜1.4ミリメートル）。合成されたmRNAとアフリカツメガエル卵母細胞のマイクロインジェクションは簡単に翻訳手順を分析するために実施することができます。このビューでは、他の利点を提供します。減数分裂の進行の速さと翻訳のmRNAのマイクロインジェクション（〜24時間）の後を考えると、 アフリカツメガエル卵母細胞は、再構成された携帯（ 大腸菌から抽出された、小麦胚芽やウサギ網状赤血球…）システムmRNAがある、と比較して高速なシステムを表しています縮小翻訳速度とし、低速で翻訳。だから、mRNA中に導入された変異の効果はすぐに観測可能となり、簡単にいくつかの卵母細胞で研究。 アフリカツメガエル卵母細胞のもう一つの利点は、母性mRNAが潜伏しているとタンパク質翻訳がプロゲステロンの刺激の前にブロックされていることです。プロゲステロンの添加は、このように、翻訳の誘導を制御するための良い手段です。細胞質Polyadenylationは卵形成時に発生しません。これは、時間順にプロゲステロンで刺激した卵母細胞で卵成熟の間に始まり、開発の初期段階を通じて継続し、翻訳の異なる段階を研究するために使用することができます。
MOS mRNAのポリアデニル化が起こり、最初のうちであり、それはチャールズワースらに定義されている「早期成熟」遺伝子のクラスにオーロラA / Eg2の、ヒストン様B4 mRNAと属しています。（2004）9。そのようなサイクリンA1およびサイクリンB1と「後期」のmRNAの翻訳の誘導は、胚胞崩壊（GVBD）の頃に発生します。 MOS mRNAは、セリン/スレオニンプロテインキナーゼをコードします。それは間接的に卵成熟を活性化するMAPキナーゼカスケードを誘発するので、その翻訳は非常に重要です。実際には、プロゲステロンに応答して、MOS mRNAのポリアデニル化を目でオーロラA / Eg2の調節タンパク質および他のRNA結合タンパク質を伴うプロセスを介して促進されますMOS mRNAの電子3'UTR。 MOS mRNAのこの増加したポリアデニル化は、次にMEK1を活性化するMOSタンパク質レベルの増加をもたらします。このプロセスは、細胞外シグナル調節キナーゼ2（ERK2）（ 図1）の活性化を媒介します。このシグナル伝達カスケードは、その後成熟M期促進因子、サイクリンBとはCdc2キナーゼによって形成された複合体をトリガーし、最終的に減数分裂再開につながることができます。
アフリカツメガエル卵母細胞したがって、そのようなMOSなどの母性mRNAの研究では、簡単にいくつかのモス、シグナリング成分もGVBD率の決意を含めての翻訳への効率的なポリアデニル化のいくつかのエンドポイントとその翻訳可能をテストするために使用することができます。このシステムは、新たに転写されたmRNAまたはトランスフェクション効率を妨害することなく、翻訳開始因子の突然変異の最初の結果を評価することは興味深いことである問題がしばしば発生してeukary耳の細胞研究。
ここでは、プロトコルは、 アフリカツメガエル卵母細胞と母性mRNAの翻訳をテストするに変異eIF4G1のmRNAが微量注入される確立されています。卵母細胞の減数分裂細胞周期を通って、初期および後期のクラスのmRNAのその後の翻訳のために進行に不可欠であるGVBD進行中の欠陥、MOSのmRNAのポリアデニル化の存在下で確認されます。リン酸化オーロラA / Eg2のおよびERKものMOS deregulation.Thusの結果を確認するために検討され、 アフリカツメガエル卵母細胞は、mRNAの翻訳の異なるステップを分析するための簡単な方法を表します。
Protocol
Representative Results
Discussion
翻訳は、いくつかの神経変性疾患を含む多数のヒトの疾患の生理病理学に関与する機構です。パーキンソン病における例えばいくつかの報告は、遺伝性突然変異8,12,13に関連付けられている訳で障害を示唆しました。
いくつかの細胞モデルは、翻訳を勉強するために利用可能です。ここでは、eIF4G1とeIF4Eのパートナー8との間の相互作用を減少させるなどの…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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