Xenopus laevis come un modello per individuare Traduzione Impairment
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
La sintesi proteica è un processo fondamentale per l'espressione genica impattare diversi processi biologici particolare adattamento alle condizioni ambientali. La fase di inizio, che prevede il montaggio delle subunità ribosomali del mRNA codone di iniziazione, iniziazione fattore coinvolto compreso eIF4G1. Difetti di questo fattore limitante della traduzione sono legate a disturbi diversi. Per studiare le possibili conseguenze di tali liberalizzazioni, Xenopus laevis oociti costituiscono un modello attraente con un alto grado di conservazione dei meccanismi cellulari e molecolari essenziali con umana. Inoltre, durante la maturazione meiotica, ovociti vengono trascrizionalmente repressi e tutte le proteine necessarie sono stati tradotti dal preesistenti, mRNA di origine materna. Questo modello economico consente di mRNA esogena di diventare perfettamente integrati con una traduzione efficace. Qui viene descritto un protocollo per valutare traduzione con un fattore di interesse (qui eIF4G1) utilizzando storcato mRNA materno che sono il primo ad essere poliadenilato e tradotti durante la maturazione degli ovociti come una lettura fisiologico. In un primo momento, mRNA sintetizzato mediante trascrizione in vitro di plasmidi di interesse (qui eIF4G1) vengono iniettati in ovociti e cinetica di maturazione degli ovociti di rilevamento Ripartizione Germinal Vesicle è determinata. Il target mRNA materno studiato è la serina / treonina mos-proteina-chinasi. La sua poliadenilazione e la sua successiva traduzione sono studiati insieme con l'espressione e la fosforilazione delle proteine dei mos segnalazione cascata coinvolti nella maturazione degli ovociti. Variazioni del protocollo corrente a presentare difetti traslazionali sono proposti anche per sottolineare la sua applicabilità generale. Alla luce delle prove che aberrante la sintesi proteica può essere coinvolto nella patogenesi di disordini neurologici emergenti, tale modello offre l'opportunità di valutare facilmente questo deterioramento e identificare nuovi bersagli.
Introduction
Le proteine sono elementi essenziali della vita cellulare, e quindi a più ampia scala dell'organismo. Essi assicurano la maggior parte delle funzioni cellulari tra cui struttura, il trasporto, la reazione di catalisi, regolazione, ecc genica La loro espressione è il risultato di un complesso meccanismo di traduzione che consente la conversione di un mRNA in proteine. La traduzione viene sottoposta a diversi controlli di adattarsi e di regolare l'espressione genica secondo le esigenze cellulari, durante lo sviluppo e differenziamento, invecchiamento, stress fisiologici o manifestazioni patologiche.
Traduzione è diviso in 3 fasi (inizio, allungamento e terminazione) e presenta 3 sistemi di traduzione iniziazione al fine di rispondere a queste esigenze: cap-dipendente, cap-indipendenti con interno ribosoma Entry Segment (IRES) strutture ed esaltatori di traduzione cap-indipendente ( CITE).
La maggior parte dei mRNA eucarioti sono tradotti in un cap-Dependent modo tramite il 7-methylguanosine cap 5'-trifosfato, che serve come una funzione di riconoscimento durante la sintesi proteica. Questo cappuccio si lega a eIF4E, un componente del complesso eIF4F con eIF4G1 e eIF4A. Associato con altri partner come poli (A) binding protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, questi fattori inizio della traduzione permette di circularize mRNA e migliorarne l'accessibilità a forme 43S complesso fino a quando l'inizio codone AUG riconoscimento 1. Questo evento corrisponde alla fine del cioè inizio della traduzione, il primo passo della traduzione.
Traduzione Cap-indipendente è utilizzato da codifica mRNA per proteine essenziali in condizioni di stress che inducono per la proliferazione cellulare e l'apoptosi esempio. Questo meccanismo coinvolge strutture secondarie in mRNA 5'regione non tradotta (UTR) chiamato IRES, l'estremità carbossi-terminale di eIF4G1 associata con eIF4A e il complesso 43S. Il legame di questo 43S di pre-apertura complex all'IRES inizia il tappo traduzione indipendente senza la necessità di fattore eIF4E 2,3.
Infine, un altro meccanismo di traduzione ancora non ben compreso supporta questa attività di traduzione cap-indipendente in condizioni di stress attraverso CITE strutture situate all'interno mRNA UTR 4.
Attraverso queste diverse modalità di traduzione diverso da loro passi di iniziazione, la traduzione gioca un ruolo fondamentale nella omeostasi cellulare e qualsiasi modifica di uno di questi processi sarebbe quindi un impatto l'organismo con piccole e gli effetti su larga scala. In effetti, l'avvio è un fattore limitante che disciplina i processi di traduzione corretta di mRNA in proteine ed è quindi l'obiettivo di numerosi controlli e punti di regolazione 5. Sia che si tratti per quest'ultimo o per i componenti di questi processi, se si risulta essere difettoso, sarà perturbare l'equilibrio stabilito nella cella e quindi potrebbe portare a Condi patologicazioni. In questo contesto, le mutazioni in fattori di traduzione sono stati coinvolti in diverse patologie, tra cui malattie neurodegenerative come `leucoencefalopatia con vanishing bianco matter' (eIF2B1-5 subunità) 6, nella sindrome di Walcott-Rallison (gene che codifica per EIF2AK3 PERK) 7, potenzialmente in malattia (eIF4G1 p.R1205H) di Parkinson 8. E 'quindi importante per condurre studi cellulari e molecolari di queste proteine mutanti di aumentare le nostre conoscenze sullo sviluppo della malattia e sul processo generale di inizio della traduzione.
Per eseguire questi studi, è fondamentale scegliere i modelli più adeguati per osservare le conseguenze di queste mutazioni Xenopus laevis oociti sono particolarmente adatti per le loro proprietà fisiologiche e biochimiche. Sincronicità fisiologica (bloccato in fase G2 del ciclo cellulare) , elevata capacità di sintesi proteica (200-400 ng / giorno / ovocita), elevato numero di OOC estrattoytes da uno stesso animale (800-1000 ovociti / femmina) e la dimensione della cella (1,2-1,4 mm di diametro) che facilita la loro manipolazione. Microiniezione degli ovociti di Xenopus con sintetizzato mRNA può essere facilmente eseguita per sezionare passi di traduzione. In questa vista si presenta altri vantaggi. Data la velocità di progressione meiosi e della traduzione dell'mRNA dopo microiniezione (~ 24 ore), Xenopus ovociti rappresenta un sistema veloce rispetto ai sistemi ricostituiti cellulari (estratti da E.coli, germi di grano o di coniglio reticolociti …) in cui un mRNA è tradotto con un tasso di traduzione ridotta e ad una velocità inferiore. Quindi, gli effetti di una mutazione introdotta in un mRNA saranno rapidamente e facilmente osservabile studiato in molti ovociti. Un altro vantaggio di ovociti di Xenopus è che mRNA materni sono latenti e la traduzione delle proteine è bloccato prima della stimolazione progesterone. L'aggiunta di progesterone è quindi un buon mezzo per controllare l'induzione di traduzione. Citoplasmatica polyadenylation non si verifica durante l'oogenesi. Inizia la maturazione degli ovociti in durante ovociti progesterone stimolata in un ordine temporale e continua durante tutto lo sviluppo precoce e potrebbe essere utilizzato per studiare le diverse fasi della traduzione.
La poliadenilazione di mos mRNA è tra i primi a verificarsi e appartiene con Aurora A / Eg2, istoni-Like B4 mRNA alla classe dei geni "di maturazione precoce" come definite nel Charlesworth et al. (2004) 9. L'induzione di traslazione dell'mRNA "tardive", come ciclina A1 e ciclina B1 si verifica intorno al momento della ripartizione vescicola germinale (GVBD). Mos mRNA codifica per una chinasi serina / treonina-proteine. La sua traduzione è di fondamentale importanza in quanto induce la chinasi MAP cascata che attiva indirettamente la maturazione dell'ovocita. Infatti, in risposta al progesterone, poliadenilazione di mRNA mos è migliorata tramite un processo che coinvolge Aurora A / Eg2 proteine regolatrici e di altre proteine di legame con RNA the 3'UTR di mRNA mos. Questo aumento di poliadenilazione mos mRNA porta ad un aumento del livello di proteina MOS, che a sua volta attiva MEK1. Questo processo media l'attivazione della chinasi di segnalazione regolata extracellulare 2 (ERK2) (Figura 1). Questa cascata di segnalazione può quindi innescare la maturazione fase M promuovere fattori, un complesso formato da ciclina B e Cdc2 chinasi, e alla fine si traduce in ripresa meiotica.
Quindi in Xenopus laevis ovociti, lo studio di mRNA materni quali mesi potrebbe facilmente essere usato per testare la loro traducibilità con diversi endpoint dal loro poliadenilazione efficiente alla traduzione di alcuni mesi di segnalazione componenti, tra cui anche la determinazione del tasso GVBD. Questo sistema è quindi interessante valutare le prime conseguenze delle mutazioni dei fattori di inizio della traduzione senza interferenze di recente trascritto mRNA o di efficienza di trasfezione, i problemi spesso si verificano con eukarystudi sulle cellule otic.
Qui, un protocollo si stabilisce dove mRNA eIF4G1 mutanti sono microiniettati in Xenopus laevis ovociti e la traduzione di mRNA materno è testato. In presenza di un difetto nel GVBD progressione, mos mRNA poliadenilazione che è essenziale per la progressione attraverso il ciclo cellulare meiotica ovocita e per la successiva traduzione di mRNA precoci e tardivi classe è accertata. La fosforilazione Aurora A / Eg2 e ERK è anche studiato per confermare la conseguenza di mos deregulation.Thus, ovociti di Xenopus rappresentano un modo semplice per analizzare diverse fasi di traduzione dell'mRNA.
Protocol
Representative Results
Discussion
La traduzione è un meccanismo coinvolto nella fisiopatologia di numerose patologie umane, tra cui diverse malattie neurodegenerative. Per esempio nella malattia di Parkinson diversi rapporti hanno suggerito la riduzione di valore in traduzione associata a mutazioni ereditarie 8,12,13.
Diversi modelli cellulari sono a disposizione per lo studio di traduzione. Qui, al fine di studiare gli effetti traduzionali di una mutazione in eIF4G1 che agisce come dominante negativo mutazione r…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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