Xenopus laevis som en modell for å identifisere Oversettelse Nedskrivning
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
Proteinsyntesen er en grunnleggende prosess for å genuttrykk påvirker ulike biologiske prosesser særlig tilpasning til miljøforhold. Initiering trinnet, som innebærer montering av ribosomale underenhetene på mRNA initieringskodonet, involvert initiering faktor inkludert eIF4G1. Defekter i dette hastighetsbegrensende trinnet i oversettelse er knyttet til ulike lidelser. Å studere de potensielle konsekvensene av slike dereguleringer, laevis Xenopus oocytter utgjør en attraktiv modell med høy grad av bevaring av viktige cellulære og molekylære mekanismer med menneske. I tillegg, under meiotisk modning, ubefruktede egg er transcriptionally trykt og alle nødvendige proteiner er oversatt fra forhåndseksisterende, maternelle mRNA. Denne rimelige modellen kan eksogene mRNA å bli perfekt integrert med en effektiv oversettelse. Her beskrives en protokoll for vurdering oversettelse med en faktor av interesse (her eIF4G1) bruker lagered mors mRNA som er de første til å bli polyadenylert og oversatt under oocytmodningen som en fysiologisk avlesning. I begynnelsen mRNA syntetisert ved in vitro transkripsjon av plasmider av interesse (her eIF4G1) injiseres i egg og kinetikk av oocytmodningen etter Germinal Vesikkel Sammenbrudd deteksjon er bestemt. Den studerte mors mRNA målet er serin / treonin-protein-kinase mos. Dens polyadenylering og påfølgende oversettelse etterforskes sammen med uttrykk og fosforylering av proteiner av MOS signal involvert i oocytmodningen kaskade. Varianter av den aktuelle protokollen til å legge frem translasjonsforskning defekter er også foreslått å understreke sin generelle egnethet. I lys av nye bevis for at avvikende proteinsyntesen kan være involvert i patogenesen av nevrologiske lidelser, gir en slik modell muligheten til enkelt å vurdere dette verdifall og identifisere nye mål.
Introduction
Proteiner er viktige elementer for cellenes liv og dermed på større skala av organismen. De sikrer de fleste cellulære funksjoner inkludert struktur, transport, reaksjonskatalyse, regulering, genekspresjon etc. Deres uttrykk er resultatet av en kompleks mekanisme for oversettelse tillate konvertering av et mRNA til protein. Oversettelsen er utsatt for forskjellige kontroller for å tilpasse og å regulere genekspresjon i henhold til celle behov, under utvikling og differensiering, aldring, fysiologiske stress eller patologiske manifestasjoner.
Oversettelse er delt inn i 3 faser (initiering, forlengelse og oppsigelse) og presenterer 3 initiering oversettelsessystemer for å svare på disse behovene: cap-avhengig, cap uavhengig via intern ribosom Entry Segment (IRES) strukturer og cap-Uavhengig Oversettelses Enhancers ( CITE).
De fleste eukaryote mRNA er oversatt i en cap-dependent måte via 7-methylguanosine 5'-trifosfat cap som fungerer som en anerkjennelse funksjonen i proteinsyntesen. Dette cap binder seg til eIF4E, en komponent av eIF4F kompleks med eIF4G1 og eIF4A. Assosiert med andre partnere som poly (A) Binding Protein (PABP), eIF2-GTP-Met-tRNA Met, disse oversettelsesinnvielses faktorene tillate å sirkulær mRNA og forbedre tilgjengeligheten til skjemaer 43s kompleks til AUG initieringskodonet anerkjennelse en. Dette arrangementet svarer til slutten av translasjons-initierings-dvs. det første trinnet av oversettelse.
Cap-uavhengig oversettelse blir brukt av mRNA som koder for essensielle proteiner under stressede forhold som induserer for eksempel celleproliferasjon og apoptose. Denne mekanismen involverer sekundære strukturer i mRNA 5'- utranslaterte region (UTR) kalt IRES, den karboksy-terminale ende av eIF4G1 forbundet med eIF4A og 43s komplekset. Bindingen av dette 43s pre-initiering complex til IRES initierer hetten uavhengig oversettelse uten behov for eIF4E faktor 2,3.
Til slutt, støtter et annet oversettelsesmekanisme fortsatt ikke godt forstått denne lua uavhengig oversettelse aktivitet under stressede forhold via CITE strukturer som ligger innenfor mRNA UTR fire.
Gjennom disse ulike former for oversettelse avviker med sine initiering trinn, spiller oversettelses en avgjørende rolle i cellulær homeostase og en hvilken som helst endring i en av disse prosessene vil derfor påvirke organismen med små til store effekter. Faktisk, er initieringen et hastighetsbegrensende trinn regulerer korrekt oversettelse prosesser av mRNA til proteiner, og er således gjenstand for en rekke kontroller og reguleringspunkter 5. Enten det er for det sistnevnte eller for komponenter av disse prosessene, hvis man viser seg å være defekt, vil det forstyrre den etablerte balansen i cellen, og derved kan føre til patologiske Condisjoner. I denne sammenheng har mutasjoner i omregningsfaktorer vært involvert i flere lidelser inkludert nevrodegenerative lidelser som `leukoencefalopati med forsvinnende hvit matter' (eIF2B1-5 subenhet) 6, i Walcott-Rallison syndrom (EIF2AK3 genet som koder for PERK) 7, potensielt i Parkinsons sykdom (eIF4G1 p.R1205H) 8. Det er derfor viktig å gjennomføre cellulære og molekylære studier av disse muterte proteiner for å øke vår kunnskap om sykdomsutvikling og på den generelle prosessen med oversettelse innvielse.
For å utføre disse undersøkelsene, er det viktig å velge de mest egnede modeller for å observere konsekvensene av disse mutasjonene Xenopus laevis oocytter er spesielt godt tilpasset på grunn av deres fysiologiske og biokjemiske egenskaper:. Fysiologisk synkronitet (blokkert i fase G2 av cellesyklus) Stor kapasitet av proteinsyntese (200-400 ng / dag / oocytt), høyt antall ekstrahert oocytes fra en samme dyr (800-1000 ubefruktede egg / kvinne) og cellestørrelse (1.2 til 1.4 mm i diameter) som letter deres manipulasjon. Mikroinjeksjon av Xenopus oocytter med syntetisert mRNA kan enkelt utføres for å dissekere oversettings trinn. I denne visningen presenterer det andre fordeler. Gitt hastighet av meiose og progresjon av translasjon mRNA etter mikroinjeksjon (~ 24 timer), representerer Xenopus oocytt et fast system sammenlignet med rekonstituert cellulære systemer (utvunnet fra E. coli, hvete bakterier eller kanin retikulocytt …), hvor et mRNA er settes med en redusert oversettelse hastighet og til en lavere hastighet. I så fall vil effekten av en mutasjon introdusert i et mRNA være raskt observerbar og enkelt studert i flere eggceller. En annen fordel med Xenopus oocytter er at mors mRNAs er latent og protein oversettelsen er blokkert før progesteron stimulering. Tilsetning av progesteron er således et godt middel til å regulere oversettelsen induksjon. Cytoplasmatisk polyadenylation forekommer ikke ved oogenesen. Det begynner i løpet oocytmodningen i progesteron-stimulert ubefruktede egg i en tidsmessig rekkefølge og fortsetter gjennom tidlig utvikling og kan brukes til å studere de ulike trinnene i oversettelse.
Polyadenyleringen av MOS mRNA er blant de første til å skje, og det hører med Aurora A / EG2, Histone-Like B4 mRNA til klassen av "tidlig modning" gener som definert i Charlesworth et al. (2004) 9. Translasjonsforskning induksjon av "sent" mRNA som Cyclin A1 og Cyclin B1 skjer rundt tidspunktet for Germinal vesikkel sammenbrudd (GVBD). Mos mRNA koder for et serin / treonin-protein kinase. Oversettelsen er avgjørende fordi det fremkaller MAP kinase kaskade som indirekte aktiverer oocytmodningen. Faktisk, i respons til progesteron er polyadenylering av mRNA MOS økes via en prosess som omfatter Aurora A / EG2 regulatoriske proteiner og andre RNA-bindende proteiner med the 3'UTR av mos mRNA. Denne økte polyadenylering av mRNA mos fører til en økning av MOS-protein-nivå, som i sin tur aktiverer MEK1. Denne prosessen medierer aktivering av det ekstracellulære signalregulerte kinase 2 (ERK2) (figur 1). Denne signalkaskade kan da utløse modningen M-fase fremme faktorer, et kompleks dannet av syklin B og Cdc2 kinase, og til slutt resulterer i meiotisk gjenopptagelse.
Derfor i Xenopus laevis oocytter, kan studiet av mors mRNA som mos lett brukes til å teste deres translatability med flere endepunkter fra deres effektiv polyadenylering til oversettelse av flere MOS signaleringskomponenter, herunder også bestemmelse av GVBD rate. Dette systemet er derfor interessant å evaluere de første konsekvenser av mutasjoner i translasjonsinitiering faktorer uten innblanding av nylig transkribert mRNA eller av transfeksjonseffektivitet, oppstår ofte problemer med eukaryotiske cellestudier.
Her er en protokoll etablert der mutant eIF4G1 mRNA er mikroinjisert i Xenopus laevis oocytter og oversettelsen av mors mRNA er testet. I nærvær av en defekt i GVBD progresjon, mos mRNA polyadenylering som er avgjørende for progresjon gjennom eggcelle meiotisk cellesyklusen og for den påfølgende oversettelse av tidlige og sene klasse mRNA er konstatert. Fosforyleringen Aurora A / EG2 og ERK blir også undersøkt for å bekrefte konsekvens av MOS deregulation.Thus, Xenopus oocytter representerer en enkel måte for å analysere forskjellige trinn av mRNA oversettelse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Oversettelse er en mekanisme involvert i patofysiologien av mange menneskelige lidelser, inkludert flere nevrodegenerative sykdommer. For eksempel ved Parkinsons sykdom flere rapporter antydet at verdifallet i oversettelse i forbindelse med arvelige mutasjoner 8,12,13.
Flere cellemodeller er tilgjengelige for å studere oversettelse. Her, for å studere konsekvensene av translasjonelle en mutasjon i eIF4G1 som virker som negativ dominant mutasjon redusere interaksjonen mellom eIF4…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Bio. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lopez-Lastra, M., Rivas, A., Barria, M. I. Protein synthesis in eukaryotes: the growing biological relevance of cap-independent translation initiation. Biol Res. 38 (2-3), 121-146 (2005).
- Terenin, I. M., Andreev, D. E., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N. A novel mechanism of eukaryotic translation initiation that is neither m7G-cap-, nor IRES-dependent. Nucleic Acids Res. 41 (3), 1807-1816 (2013).
- Sonenberg, N., Hinnebusch, A. G. Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell. 136 (4), 731-745 (2009).
- Van der Knaap, M. S., Leegwater, P. A., Könst, A. A., Visser, A., Naidu, S., Oudejans, C. B., Schutgens, R. B., Pronk, J. C. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol. 51 (2), 264-270 (2002).
- Senée, V., Vattem, K. M., Delépine, M., Rainbow, L. A., Haton, C., Lecoq, A., et al. Wolcott-Rallison Syndrome: clinical, genetic, and functional study of EIF2AK3 mutations and suggestion of genetic heterogeneity. Diabetes. 53 (7), 1876-1883 (2004).
- Chartier-Harlin, M. C., Dachsel, J. C., Vilariño-Güell, C., Lincoln, S. J., Leprêtre, F., Hulihan, M. M., et al. Translation initiator EIF4G1 mutations in familial Parkinson disease. Am J Hum Genet. 89 (3), 398-406 (2011).
- Charlesworth, A., Cox, L. L., MacNicol, A. M. Cytoplasmic polyadenylation Element (CPE)- and CPE-binding Protein (CPEB)-independent mechanisms regulate early class maternal mRNA translational activation in Xenopus oocytes. J Biol Chem. 279 (17), 17650-17659 (2004).
- Dumont, J. N. Oogenesis in Xenopus laevis. J Morphol. 136, 153-180 (1972).
- Rassa, J. C., Wilson, G. M., Brewer, G. A., Parks, G. D. Spacing constraints on reinitiation of paramyxovirus transcription: the gene end U tract acts as a spacer to separate gene end from gene start sites. Virology. 274, 438-449 (2000).
- Lin, W., Wadlington, N. L., Chen, L., Zhuang, X., Brorson, J. R., Kang, U. J. Loss of PINK1 attenuates HIF-1α induction by preventing 4E-BP1-dependent switch in protein translation under hypoxia. J Neurosci. 34 (8), 3079-3089 (2014).
- Martin, I., Kim, J. W., Lee, B. D., Kang, H. C., Xu, J. C., Jia, H. 2., Stankowski, J., et al. Ribosomal protein s15 phosphorylation mediates LRRK2 neurodegeneration in Parkinson’s disease. Cell. 57 (2), 472-485 (2014).
- Cohen, S., Au, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis oocytes. J Vis Exp. (24), (2009).
- Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. (69), e4449 (2012).
- Keiper, B. D., Rhoads, R. E. Translational recruitment of Xenopus maternal mRNAs in response to poly(A) elongation requires initiation factor eIF4G-1. Dev Biol. 206 (1), 1-14 (1999).
- Wakiyama, M., Imataka, H., Sonenberg, N. Interaction of eIF4G with poly(A)-binding protein stimulates translation and is critical for Xenopus.oocyte maturation. Curr Biol. 10 (18), 1147-1150 (2000).
- Sheets, M. D., Wu, M., Wickens, M. Polyadenylation of c-mos mRNA as a control point in Xenopus meiotic maturation. Nature. 374 (6522), 511-516 (1995).
- Gebauer, F., Richter, J. D. Synthesis and function of Mos: the control switch of vertebrate oocyte meiosis. Bioessays. 19 (1), 23-28 (1997).
- Le Sommer, C., Lerivray, H., Lesimple, M., Hardy, S. Xenopus as a model to study alternative splicing in vivo. Biol Cell. 99 (1), 55-65 (2007).
- Au, S., Cohen, S., Panté, N. Microinjection of Xenopus laevis.oocytes as a system for studying nuclear transport of viruses. Methods. 51 (1), 114-120 (2010).
- Gotoh, T., Villa, L. M., Capelluto, D. G., Finkielstein, C. V. Regulatory pathways coordinating cell cycle progression in early Xenopus development. Results Probl Cell Differ. 53, 171-199 (2011).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nat Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Moreno, J. A., Halliday, M., Molloy, C., Radford, H., Verity, N., Axten, J. M., et al. Oral treatment targeting the unfolded protein response prevents neurodegeneration and clinical disease in prion-infected mice. Sci Transl Med. 5 (206), 206ra138 (2013).
- Doyle, K. M., Kennedy, D., Gorman, A. M., Gupta, S., et al. Unfolded proteins and endoplasmic reticulum stress in neurodegenerative disorders. J Cell Mol Med. 15 (10), 2025-2039 (2011).
- Gandin, V., Sikström, K., Alain, T., Morita, M., McLaughlan, S., Larsson, O., Topisirovic, I. Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale. J Vis Exp. (87), e51455 (2014).
