Xenopus अनुवाद हानि की पहचान के लिए एक मॉडल के रूप laevis
Summary
Protein synthesis control occurs mainly at the translation initiation step, deficiencies in which are linked to diverse disorders. To better understand their etiology, we described here a protocol using Xenopus laevis oocytes assessing the translation of mos transcript in the presence of a mutant of translation initiation factor eIF4G1.
Abstract
प्रोटीन संश्लेषण विविध जैविक प्रक्रियाओं पर्यावरण की स्थिति के लिए विशेष रूप से अनुकूलन को प्रभावित जीन अभिव्यक्ति के लिए एक बुनियादी प्रक्रिया है। mRNA दीक्षा कोडोन, eIF4G1 सहित शामिल दीक्षा कारक पर राइबोसोमल सब यूनिटों के विधानसभा शामिल है जो दीक्षा कदम,। अनुवाद की इस दर सीमित कदम में दोष विविध विकारों से जुड़े होते हैं। ऐसे deregulations के संभावित परिणामों का अध्ययन करने के लिए, Xenopus oocytes मानव के साथ आवश्यक सेलुलर और आणविक तंत्र के संरक्षण के उच्च डिग्री के साथ एक आकर्षक मॉडल का गठन laevis। इसके अलावा, अर्धसूत्रीविभाजनिक परिपक्वता के दौरान, oocytes transcriptionally दमित कर रहे हैं और सभी आवश्यक प्रोटीन पहले से मौजूद, माता के रूप में ली गई mRNAs से अनुवाद कर रहे हैं। यह सस्ता मॉडल के लिए एक प्रभावी अनुवाद के साथ पूरी तरह से एकीकृत बनने के लिए बहिर्जात mRNA के लिए सक्षम बनाता है। यहाँ (eIF4G1 यहाँ) ब्याज की एक कारक के साथ अनुवाद का आकलन stor प्रयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल वर्णन किया गया हैपहली बार कर रहे हैं कि मातृ mRNA एड polyadenylated और एक शारीरिक readout के रूप में डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौरान अनुवाद करने के लिए। सबसे पहले, mRNA के हित के प्लास्मिडों (यहाँ eIF4G1) की इन विट्रो प्रतिलेखन द्वारा synthetized कीटाणु पुटिका टूटने का पता लगाने के द्वारा oocytes और डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के कैनेटीक्स में इंजेक्ट कर रहे हैं निर्धारित किया जाता है। अध्ययन किया मातृ mRNA लक्ष्य सेरीन / threonine प्रोटीन काइनेज राज्यमंत्री है। इसके polyadenylation और इसके बाद के अनुवाद डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता में शामिल झरना संकेत राज्यमंत्री के प्रोटीन की अभिव्यक्ति और फास्फोरिलीकरण के साथ मिलकर जांच कर रहे हैं। वर्तमान प्रोटोकॉल के बदलाव आगे रख अनुवादकीय दोष भी अपने सामान्य प्रयोज्यता पर जोर देना प्रस्तावित है। न्यायपालिका प्रोटीन संश्लेषण मस्तिष्क संबंधी बीमारियों के रोगजनन में शामिल किया जा सकता है कि सबूत उभरते के प्रकाश में, इस तरह के एक मॉडल को आसानी से इस हानि का आकलन करने और नए लक्ष्यों की पहचान करने का अवसर प्रदान करता है।
Introduction
प्रोटीन जीव की बड़े पैमाने पर आवश्यक सेलुलर जीवन के तत्वों और इस तरह कर रहे हैं। वे संरचना, परिवहन, प्रतिक्रिया कटैलिसीस, विनियमन, जीन अभिव्यक्ति आदि उनकी अभिव्यक्ति प्रोटीन में एक mRNA के रूपांतरण की अनुमति के अनुवाद का एक जटिल तंत्र का परिणाम है सहित सेलुलर कार्यों के बहुमत किया जाता है। अनुवाद अनुकूल करने के लिए और विकास और भेदभाव, उम्र बढ़ने, शारीरिक तनाव या रोग अभिव्यक्तियों के दौरान सेल की जरूरत के अनुसार जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए विभिन्न नियंत्रण के अधीन है।
टोपी पर निर्भर है, टोपी-स्वतंत्र आंतरिक राइबोसोम एंट्री सेगमेंट (IRES) संरचनाओं और टोपी स्वतंत्र अनुवाद Enhancers (वाया: अनुवाद 3 दीक्षा अनुवाद प्रणालियों इन जरूरतों पर प्रतिक्रिया करने के क्रम में तीन चरणों (दीक्षा, बढ़ाव और समापन) और तोहफे में बांटा गया है ) हवाला देते हैं।
अधिकांश यूकेरियोटिक mRNA के एक टोपी depe में अनुवाद कर रहे हैंप्रोटीन संश्लेषण के दौरान एक मान्यता सुविधा के रूप में कार्य करता है कि 7-methylguanosine 5'-ट्रायफ़ोस्फेट टोपी के माध्यम से ndent तरीके से। इस टोपी eIF4E, eIF4G1 और eIF4A साथ eIF4F परिसर के एक घटक को बांधता है। पाली (ए) बाध्यकारी प्रोटीन (PABP) जैसे अन्य भागीदारों के साथ जुड़े, eIF2-जीटीपी-मेट-tRNA मेट, इन अनुवाद दीक्षा कारकों mRNA के परिपत्र फेरना और मान्यता 1 कोडोन अगस्त दीक्षा तक रूपों के लिए 43s जटिल इसकी पहुंच में सुधार करने के लिए अनुमति देते हैं। इस घटना अनुवाद दीक्षा यानी, अनुवाद के पहले कदम के अंत से मेल खाती है।
कैप-स्वतंत्र अनुवाद उदाहरण सेल प्रसार और apoptosis के लिए प्रेरित जोर देकर कहा कि शर्तों के तहत आवश्यक प्रोटीन के लिए mRNA एन्कोडिंग द्वारा प्रयोग किया जाता है। इस तंत्र mRNA में माध्यमिक संरचनाओं शामिल 5'- untranslated क्षेत्र (UTR) IRES कहा जाता है, eIF4A और 43s जटिल के साथ जुड़े eIF4G1 की carboxy टर्मिनल अंत। इस 43s पूर्व दीक्षा ग के बंधनIRES को omplex eIF4E कारक 2,3 के लिए आवश्यकता के बिना टोपी स्वतंत्र अनुवाद आरंभ करता है।
MRNA UTR 4 के भीतर स्थित संरचनाओं CITE के माध्यम से अंत में, अभी भी अच्छी तरह से नहीं समझा गया एक और अनुवाद तंत्र पर बल दिया शर्तों के तहत इस टोपी स्वतंत्र अनुवाद गतिविधि का समर्थन करता है।
उनकी दीक्षा कदम से भिन्न अनुवाद के इन विभिन्न साधनों के माध्यम से, अनुवाद सेलुलर homeostasis में एक महत्वपूर्ण भूमिका है और इस तरह बड़े पैमाने पर प्रभाव के लिए छोटे से जीव प्रभाव होगा इन प्रक्रियाओं में से एक में किसी भी बदलाव के लिए खेलता है। दरअसल, दीक्षा प्रोटीन में mRNA का सही अनुवाद प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने वाले एक सीमित दर कदम है और इस तरह कई नियंत्रण और विनियमन अंक 5 का लक्ष्य है। यह बाद के लिए या इन प्रक्रियाओं के घटकों के लिए है कि क्या एक दोषपूर्ण होने का पता चला है, यह सेल में स्थापित संतुलन उपद्रव जाएगा और इस प्रकार वैकृत कब्जा करने के लिए ले जा सकता हैमाहौल। इस संदर्भ में, अनुवाद कारकों में परिवर्तन ऐसे में संभावित सफेद matter' (eIF2B1-5 सबयूनिट) 6, वालकोट-Rallison सिंड्रोम में (पर्क के लिए EIF2AK3 जीन एन्कोडिंग) 7, गायब हो जाने के साथ leukoencephalopathy `के रूप में neurodegenerative विकारों सहित कई विकारों में शामिल किया गया है पार्किंसंस रोग (eIF4G1 p.R1205H) 8। यह रोग के विकास पर और अनुवाद दीक्षा की सामान्य प्रक्रिया पर हमारे ज्ञान में वृद्धि करने के लिए इन उत्परिवर्ती प्रोटीन के सेलुलर और आणविक अध्ययन का संचालन करने के लिए इसलिए महत्वपूर्ण है।
इन अध्ययनों के लिए बाहर ले जाने के लिए, यह इन म्यूटेशन के परिणामों का निरीक्षण करने के लिए सबसे पर्याप्त मॉडल का चयन करने के लिए आवश्यक है Xenopus oocytes विशेष रूप से अच्छी तरह से उनकी शारीरिक और जैव रासायनिक गुणों के कारण अनुकूलित कर रहे हैं laevis:। शारीरिक समक्रमिकता (सेल चक्र के चरण G2 में अवरुद्ध) प्रोटीन संश्लेषण की उच्च क्षमता (200-400 एनजी / दिन / डिम्बाणुजनकोशिका), निकाले OOC की उच्च संख्याएक ही पशु से ytes (800-1000 oocytes / महिला) और उनके हेरफेर सुविधा है, जो सेल आकार (व्यास में 1.2-1.4 मिमी)। संश्लेषित mRNA के साथ Xenopus oocytes के microinjection आसानी से अनुवाद कदम काटना करने के लिए किया जा सकता है। इस दृश्य में यह अन्य लाभ प्रस्तुत करता है। अर्धसूत्रीविभाजन प्रगति की गति और अनुवाद के mRNA microinjection (~ 24 घंटे) के बाद दिया, Xenopus डिम्बाणुजनकोशिका पुनर्गठन सेलुलर (कोलाई से निकाला, गेहूं रोगाणु या खरगोश रेटिकुलोसाइट …) सिस्टम एक mRNA है जिसमें की तुलना में एक तेज प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है एक कम अनुवाद दर के साथ और एक कम गति से अनुवाद किया। तो, एक mRNA में पेश एक उत्परिवर्तन के प्रभाव को जल्दी से नमूदार और आसानी से कई oocytes में अध्ययन किया जाएगा। Xenopus oocytes की एक और लाभ यह मातृ mRNAs अव्यक्त हैं और प्रोटीन अनुवाद प्रोजेस्टेरोन उत्तेजना से पहले अवरुद्ध है कि है। प्रोजेस्टेरोन के अलावा इस प्रकार अनुवाद प्रेरण नियंत्रित करने का एक अच्छा साधन है। Cytoplasmic पीolyadenylation डिम्बजनन दौरान उत्पन्न नहीं होती है। यह एक अस्थायी आदेश में प्रोजेस्टेरोन उत्तेजित oocytes में डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौरान शुरू होती है और जल्दी विकास भर में जारी है और अनुवाद के विभिन्न चरणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
राज्यमंत्री mRNA का polyadenylation घटित करने के लिए पहले के बीच में है और यह चार्ल्सवर्थ एट अल में परिभाषित के रूप में "जल्दी परिपक्वता" जीन की कक्षा में अरोड़ा ए / Eg2, हिस्टोन-तरह बी 4 mRNA के साथ संबंध रखता है। (2004) 9। ऐसे Cyclin A1 और Cyclin बी 1 के रूप में "देर" mRNA के translational प्रेरण कीटाणु पुटिका टूटने (GVBD) के समय के आसपास होता है। राज्य मंत्री mRNA के एक सेरीन / threonine प्रोटीन काइनेज encodes। यह परोक्ष रूप से डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता को सक्रिय करता है कि नक्शा काइनेज झरना लाती है के बाद से अपने अनुवाद महत्वपूर्ण है। दरअसल, प्रोजेस्टेरोन के जवाब में राज्यमंत्री mRNA का polyadenylation Eg2 नियामक प्रोटीन और वें के साथ अन्य आरएनए बंधनकारी प्रोटीन अरोड़ा ए / जुड़े एक प्रक्रिया के माध्यम से बढ़ाया हैराज्यमंत्री mRNA का ई 3'UTR। राज्यमंत्री mRNA की इस बढ़ती polyadenylation बदले में MEK1 को सक्रिय करता है जो राज्य मंत्री प्रोटीन के स्तर की वृद्धि हुई है, की ओर जाता है। इस प्रक्रिया को बाह्य संकेतन विनियमित काइनेज 2 (ERK2) (चित्रा 1) के सक्रियण मध्यस्थता करता है। यह संकेत झरना तो कारकों को बढ़ावा देने परिपक्वता एम चरण, Cyclin बी और Cdc2 काइनेज द्वारा गठित एक जटिल ट्रिगर, और अंततः अर्धसूत्रीविभाजनिक बहाली में परिणाम कर सकते हैं।
Xenopus oocytes laevis इसलिए, इस तरह के राज्यमंत्री के रूप में मातृ mRNA का अध्ययन आसानी से कई राज्यमंत्री, घटकों संकेत भी GVBD दर के निर्धारण सहित का अनुवाद करने के लिए उनके कुशल polyadenylation से कई समापन के साथ उनके translatability परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रणाली को नव लिखित mRNA का या अभिकर्मक दक्षता के हस्तक्षेप के बिना अनुवाद दीक्षा कारकों में परिवर्तन के पहले परिणामों का मूल्यांकन करने के लिए इसलिए दिलचस्प है, समस्याओं अक्सर eukary के साथ होने वालीकान का सेल अध्ययन करता है।
इधर, एक प्रोटोकॉल Xenopus oocytes laevis और मातृ mRNA का अनुवाद परीक्षण किया है में उत्परिवर्ती eIF4G1 mRNAs microinjected रहे हैं, जहां की स्थापना की है। डिम्बाणुजनकोशिका अर्धसूत्रीविभाजनिक सेल चक्र के माध्यम से और जल्दी और देर वर्ग mRNAs के बाद के अनुवाद के लिए प्रगति के लिए आवश्यक है, जो एक GVBD प्रगति में दोष, राज्यमंत्री mRNA polyadenylation की उपस्थिति में पता लगाया है। फास्फोरिलीकरण अरोड़ा ए / Eg2 और ERK भी राज्यमंत्री deregulation.Thus का परिणाम पुष्टि करने के लिए अध्ययन किया है, Xenopus oocytes mRNA के अनुवाद के विभिन्न चरणों का विश्लेषण करने के लिए एक आसान तरीका प्रतिनिधित्व करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
अनुवाद कई neurodegenerative रोगों सहित कई मानव विकारों के physiopathology में शामिल एक तंत्र है। पार्किंसंस रोग में उदाहरण के लिए कई रिपोर्टों वंशानुगत म्यूटेशन 8,12,13 के साथ जुड़े अनुवाद में हानि का सुझाव दिया।
<p class="jove_cont…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grant from INSERM, University of Lille 1, University of Lille 2, Regional Hospital Center of Lille (CHR de Lille). MCCH acknowledges supports from the Fondation de France and wishes to thank IRCL, Pr. Sonenberg for the gift of the V5-plasmids, Dr. Dissous (Pasteur Institute, Lille) for the gift of anti-GFP antibodies, UMS 3387 (University of Rennes) where Xenopus oocytes are purchased and Dr Taymans (JPArc, Lille) for critical reading of the manuscript text.
Materials
| Tricaine methane sulphonate | Sandoz | MS-222 | oocytes handling |
| Forceps | Moria | Dumont MC40 | |
| Streptomycin/penicillin | Sigma | 781 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Sigma | T9128 | |
| Tetracyclin | Sigma | T7660 | |
| Veterinarian absorbable Vicryl thread | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| Collagenase A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | Preparation of synthetic mRNA |
| DNAse/RNAse free H2O | Life Technologies | 10977 | |
| Sodium Acetate | Merck | 6268 | |
| Absolute ethanol | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| Ethidium bromide 10 mg/mL | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE® Kit | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| Agarose | Life Technologies | 16500-500 | |
| Formaldehyde 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | |
| Gel Doc Imager | Biorad | ||
| Oocyte Pipet with 100 8" Glass Capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | microinjection |
| Replacement Glass 8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0,45 µm filter | Millipore | SLHA025NB | |
| Progesterone | Sigma | P0130 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A4612 | |
| leupeptin | Sigma | L8511 | |
| aprotinin | Sigma | A1153 | |
| benzamidine | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| sodium vanadate | Sigma | S6508 | |
| Laemmli buffer | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Protein Gels, 1.0 mm, 15 well | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE electrophoresis, mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036 and -1096 | |
| horizontal semi-dry blotting system | W.E.P. Compagny | ||
| Glycine | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL Membrane | Amersham Life Science | 10401180 | |
| Methanol | VWR | 20846-292 | |
| Ponceau Red (0,5%) | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| anti-GFP | Life Technologies | A11122 | |
| anti-V5 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| anti-Eg2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| anti-Eg2-P | Cell Signaling | C39D8 | |
| anti-ERK2 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| anti-ERK2-P (Tyr204) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| anti-Rsk | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| anti-mos | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| anti-mouse horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| anti-rabbit horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| anti-goat horseradish peroxidase labeled secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| Advanced ECL Detection System | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | polyadenylation assay |
| TRIZOL (Qiazol Lysis Reagent) | Qiagen | 79306 | |
| Chloroform | Sigma | 31998-8 | |
| Isopropanol | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy mini kit | Qiagen | 74106 | |
| RTL buffer | Qiagen | 79216 | |
| RNAse free DNAse set | Qiagen | 79254 | |
| Primers | Eurogentec | ||
| T4 RNA ligase 1 | New England Biolabs | M0204S | |
| High capacity c-DNA Reverse Transcription kit | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq polymerase | Life Technologies | 10342020 |
References
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