Abstract
Vuxen råtta och människa ryggmärgen neurala stam / progenitorceller (NSPCs) odlade i tillväxtfaktor berikade mediet tillåter spridningen av multipotenta, självförnyande och expander neurala stamceller. I serumbetingelser, kommer dessa multipotenta NSPCs differentiera, att alstra neuroner, astrocyter och oligodendrocyter. Den skördade vävnaden enzymatiskt dissocierade i en papain-EDTA-lösning och därefter dissocierades mekaniskt och separeras genom en diskontinuerlig densitetsgradient för att ge en enkelcellsuspension som pläteras i Neurobasal-medium kompletterat med epidermal tillväxtfaktor (EGF), basisk fibroblasttillväxtfaktor (bFGF ), och heparin. Vuxen råttryggmärgs NSPCs odlas som fritt flytande neurosfärer och vuxna mänskliga ryggmärgen NSPCs odlas som vidhäftande kulturer. Under dessa förhållanden, vuxna ryggmärgen NSPCs föröka, express markörer av prekursorceller, och kan kontinuerligt utökas vid passage. Dessa celler kan be studeras in vitro som svar på olika stimuli, och exogena faktorer kan användas för att främja härstamning restriktion för att undersöka neurala stamcellsdifferentiering. Multi NSPCs eller deras avkomma kan också transplanteras till olika djurmodeller för att bedöma regenerativ reparation.
Introduction
NSPCs är multipotenta celler åtagit sig att den neurala härstamning som kan själv förnya och lätt expandera in vitro. Vi hänvisar till dessa celler som en blandad population av neurala stam / progenitorceller eftersom de visar egenskaper hos självförnyande multipotenta stamceller och mer begränsade föregångare. NSPCs finns i både den fetala och vuxna hjärnan och ryggmärgen 1,2. I den vuxna, NSPCs är normalt vilande och uppehålla sig inom specifika nischer inklusive subventrikulära zonen kantar de laterala ventriklama 2-4, och den periventrikulära region som omger den centrala kanalen av ryggmärgen 5,6.
Typiskt NSPCs odlas som fritt flytande neurosfärer eller som vidhäftande monoskikt i serumfritt medium kompletterat med EGF och bFGF, mitogener vilka selekterar för de stam / stamfadercellpopulationer. Den neurosphere analysen som ursprungligen utvecklades av Reynolds och Weiss 2, används oftast för kultur ochexpandera neurala stamceller. NSPCs visar multipotens när de stryks ut i tillväxtfaktorfritt medium innehållande serum, differentiera till neuron, astrocyter och oligodendrocyter. Multi kan självförnyande NSPCs isoleras och odlas från vuxna gnagare ryggmärgen när den odlade vävnaden innefattar regioner i centrala kanalen 6,7. En potentiell fördel med att använda NSPCs genereras från den vuxna ryggmärgen i motsats till att skapa celler från andra regioner är att dessa vävnadsspecifika celler liknar närmast celler i ryggmärgen som går förlorade eller skadas efter skada eller sjukdom.
Tidigare arbete har visat att neurosfärer härrör från vuxen människa ryggmärgen inte kunde förökas långvarig eller passerades för att generera ett tillräckligt antal celler 8,9. Men med modifieringar i odlingsbetingelser, rapporterade vi expansion och transplantation av vuxna människor ryggmärgs härrörande NSPCs, visar att självförnyandeoch multi NSPCs kan isoleras från vuxen människa ryggmärgen hos organtransplanterade donatorer 10. Främst, avlägsnande av det mesta av den vita substansen under dissekering och odla dessa celler på en vidhäftande substrat i tillväxtfaktor-anrikade mediet ut för prolifererande adulta humana ryggmärgen NSPCs. I detta protokoll beskriver vi skörden av ryggmärgen från vuxna råttor och från humana organtransplanterade givare, dissektion av periventrikulär vävnad och isolering, kultur och utbyggnad av NSPCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök godkänns av Animal Care kommittén vid University Health Network, Toronto ON Canada, i enlighet med de riktlinjer som fastställts i Guide till skötsel och användning av försöksdjur som utarbetats av den kanadensiska rådet om Animal Care. För skörd av mänsklig ryggmärg, var godkännande erhållits från University Health Network Forskningsetiska styrelsen och från Trillium-Gift of Life Foundation som övervakar organdonation i Ontario, Kanada.
1. Framställning av Dissection Buffertar och Odlingsmedia
- För isoleringen av råttryggmärg, förbereda 100 ml dissektion buffert (1x PBS + 0,6% glukos + 2% penicillin-streptomycin) och kyla. För human ryggmärg förbereda 100 ml dissektion buffert (1x HBSS + 0,6% glukos + 2% penicillin-streptomycin) och kylskåp.
- Bered 100 ml serumfritt medium (SFM) och varm vid 37 ° C. För att framställa SFM, tillsätt 2 mM L-glutamin, 100 ^ g / m ^l penicillin-streptomycin, 2% B27, och 10% hormonblandning till Neurobasal-Ett medium. För att framställa hormonblandning, gör en 1: 1 DMEM / F12-medium innehållande 0,6% glukos, 3 mM NaHCOs 3, 5 mM HEPES, 25 pg / ml insulin, 100 | ig / ml apo-transferrin, 10 | iM putrescin, 30 nM selen, och 20 nM progesteron.
- Förbered EFH tillväxtfaktor-anrikad plätering medier (till SFM foga 20 ng / ml EGF, 20 ng / ml bFGF, och 2 | ig / ml heparin) och varm vid 37 ° C. Se till att mänskliga EFH innehåller mänskliga rekombinanta tillväxtfaktorer (se tabell av material).
2. Skörd och Dissekering av vuxen råtta periventrikulär ryggmärgsvävnad
- Sterilisera dissekera instrument i etanol och skölj i steril saltlösning, eller autoklav instrument i förväg. Ge råtta (6 - 8 veckor gamla) en dödlig injektion av natrium pentobarbital (1 cc på 65 mg / ml) eller överdos av narkosmedel (dvs 4% isofluoran) enligt en institution godkända djur protokollet. DOuse baksidan av råtta med 70% etanol och ta bort huden på den dorsala ytan med stora dissektion sax.
- Håll saxen vinkelrätt mot ryggytan, på tvären skär ryggraden ovanför bakbenen. Använd mindre sax för att i längdriktningen klippa ryggmuskeln liggande ryggraden i en rostralt riktning för att exponera spinous processer.
- Från den exponerade caudal slutet sätter rongeurs eller en liten trubbig ben skärinstrument extradurally i den laterala aspekten av ryggradskanalen i utrymmet mellan ryggmärgen och ryggraden. Gör små snitt i lamellen (beniga valv vänster och höger om spinous processer på varje sida av ryggkotorna) och försiktigt dra bort lamina att exponera ryggmärgen (Figur 1A-D). Se till vinkeln på bladen är grund och parallellt med sladden så den underliggande ryggmärgen inte är skadad.
- Fortsätt laminektomi i rostralt riktning till mässore bröst- och livmoderhalsen ryggmärgen.
- Skära försiktigt ryggmärgen från ryggraden med trubbiga vävnad pincett och använda microscissors att noggrant skära rötterna för att frigöra kabeln. Placera den utskurna ryggmärgen i en petriskål med 4 ° C steril råtta dissektion buffert (beskriven ovan i 1,1). Skölj vävnaden i nyberedd 4 ° C dissekera buffert och använda sax klippa ryggmärgen på tvären i 1 cm segment (Figur 1E).
- För varje segment av vävnad, använda en hand för att hålla vävnaden med fin pincett. Med den andra handen, använd microscissors att försiktigt ta bort de överliggande mening, vit substans, och de flesta av den grå massan med hjälp av en dissekera omfattning. Alternativt kan du använda fin pincett (Dumont 4 #) att skala bort det mesta av grå och vit substans, vilket innebär att endast den periventrikulär regionen av ryggmärgen som innehåller ependymceller och en liten mängd av omgivande grå substans (Figur 1F-H).
- Pool dissekerade periventrikulär vävnad i en 10 cm steril petriskål med kallt råtta dissektion buffert.
3. Skörd och Dissekering av vuxen människa periventrikulär ryggmärgsvävnad
Obs: Human ryggmärgsvävnad skördas från vuxna organtransplantation givare (givare varierade i ålder från 2 till 60 år) efter det att andra organ har tagits bort för organtransplantation. Den Trillium-Gift of Life-programmet erhåller tillstånd för avlägsnande av vävnad för forskningsändamål från patientens familj och meddelar vår skörd team i en tid så att vi har kunnat skörda sladdar inom 2 timmar från aorta tvärkläm. Manliga och kvinnliga vuxna givare med negativ serologi och inga infektioner accepteras.
- Skörd vävnad på ett sterilt sätt i operationssalen genom ett främre angreppssätt med användning av samma främre exponering redan dissekerades bort organet genom organet transplant skörd laget.
- Exponera den främre ryggraden genom indragning med stora ribbspridare och stora paddla upprullningsdon av de återstående vävnader och organ, inklusive de stora blodkärlen.
- Använd en sternala såg monteras med en långt blad för att skära igenom diskarna i rostralt och stjärtfenan ändarna av önskad längd av ryggraden att opererande. Vinkel sågen ca 45 ° medialt för att skära en triangulär tråg från den laterala delen av kotkropparna stannar något under ryggradskanalen.
- Ta bort klump de mediala aspekterna av kotkropparna av de önskade segmenten med hjälp av böjda Osteotomer och klubba var noga med att undvika att skära igenom dura. Lyft sedan försiktigt dura täckt ryggmärgen med tandade pincett och kraftigt incise rostralt och stjärtfenan ändarna av sladden. Använd långa sax och pincett för att bilateralt transekt de enskilda rötter.
- Placera den utskurna segment av ryggmärgen i 4 °; C steril buffert (1x HBSS + 0,6% glukos + 2% penicillin-streptomycin) i ett stort provrör för transport till vävnadsodlingsrummet.
- Obs: I allmänhet, en 3-6 cm segment av ryggmärgen från övre bröstkorg och / eller mitten till lägsta bröstkorg nivå tas bort i operationssalen under sterila förhållanden så snart som möjligt efter avslutad cirkulation och placerades i kall steril buffert . Den tid som förflutit mellan upphörande av cirkulation och avlägsnande av ryggmärgen varierar med den tid som krävs för att skörda de riktade organ för donation och har varierat från 45 min till 2 timmar. Om hjärtat och lungorna har också tagits bort, kan dissektion tas långt rostrally att skörda en del av den lägre livmoderhalscancer sladden också.
- Dissekera humana ryggmärgsvävnad så snart som möjligt efter skörd, i allmänhet inom tre timmar. Ta bort dura och andra hjärnhinnorna med pincett. Skölj ryggmärg i nygjorda 4 ° C dissektion buffert ochskäras på tvären in i en cm segment.
- Med hjälp av en dissekera omfattning, skära de överliggande mening, vita substansen, och de flesta av grå med hjälp av vävnad pincett, fin pincett och microscissors för varje mjukpapper. Pool dissekerade periventrikulär vävnad, vilket inkluderar ependymceller och en liten mängd av omgivande grå, i en 10 cm steril petriskål med kallt mänskliga dissektion buffert.
4. Isolering och odling av vuxna råtta och människa ryggmärg NSPCs
- Utför följande steg aseptiskt i ett laminärt flöde huva.
- Finhacka dissekerade råtta eller människa periventrikulär vävnad i 1 mm 3 bitar med microscissors.
- Enzymatiskt dissociera malet vävnad med proteolytiska enzymer med hjälp av papain dissociation sats som anges i tabellen över material / reagens. Obs: reagenskomponenter inkluderar 4 flaskor; Ampull 1: Earles balanserade saltlösning (EBSS), Vial 2: Papain containing L-cystein och EDTA, Vial 3: deoxiribonukleas I (DNas), Flaska 4: Ovomucoid proteashämmare med bovint serumalbumin (BSA).
Obs! Obs: Papain är en sulfhydryl proteas som har en bred specificitet för proteinsubstrat. Papain häri härleds från latexen från Carica papaya anläggningen och försämrar de flesta proteinsubstrat i större utsträckning än pankreatiska proteaser. Under dissociation processen finns det vissa cellskada orsakar DNA att släppas in i dissociation medium som kommer att öka viskositeten och göra pipettering svårt. Således är DNas ingår i cellisoleringsproceduren att smälta DNA utan att skada intakta celler. Ovomucoids är glykoprotein proteashämmare som används för att hämma papain aktiviteten efter dissociation steg.
- Vid första användningen, rekonstituera blandningen (flaska 4) albumin ovomukoid hämmare med 32 ml EBSS (flaska 1), och sedan lagra vid 4 ° C och användas för efterföljande isoleringar.Anmärkning: Detta ger en lösning vid en effektiv koncentration av 10 mg ovomukoid inhibitor och 10 mg albumin per ml.
- Lägg 5 ml EBSS (flaska 1) till en papain flaska (flaska 2), vilket gav en lösning vid 20 enheter av papain / ml i 1 mM L-cystein med 0,5 mM EDTA. Kontrollera att papainlösning visas klart när fullständigt upplöst, annars placera flaskan i ett 37 ° C vattenbad i tio minuter tills papain är fullständigt upplöst för att säkerställa full aktivitet hos enzymet.
- Lägg 500 | il EBSS (flaska 1) till en DNas flaska (flaska 3) och blanda försiktigt som DNas är känslig för skjuvning denaturering. Lägg 250 pl av DNas lösning på injektionsflaskan med papain, vilket resulterar i en slutlig koncentration av cirka 20 enheter / ml papain och 0,005% DNas. Spara resten av DNas flaskan för att använda senare.
- Placera det malda råtta eller mänsklig vävnad i papainlösning som framställts i steg 4,4 ovan. För mänsklig vävnad isolering, dela malet vävnaden lika mellan tvåpapain flaskor (ca 0,2 g / flaska).
- Inkubera vid 37 ° C under konstant omrörning på en rocker plattform för att dissociera vävnaden i den aktiverade papainlösning. Inkubera råttvävnad under 45 min till 1 timme och mänsklig vävnad för 1 till 2 timmar, beroende på mängden av malet vävnad, ca 0,2-0,4 g respektive.
- Finfördela blandningen med en 10 ml pipett för att dissociera eventuella återstående vävnadsbitar för att ge en grumlig cellsuspension. Överför cellsuspensionen (inkluderar inte några bitar av odissocierad vävnad) i en steril 15 ml koniska rör och centrifugera vid 300 xg under 5 minuter vid RT.
- Resuspendera pelleterat celler i medium innehållande ovomukoid, en papain hämmare.
- Förbered ovomukoid lösningen genom att blanda 2,7 ml EBSS (flaska 1) med 300 pl av den färdigberedda albumin ovomukoid inhibitorlösning (flaska 4) i en 15 ml koniska rör. Tillsätt 150 pl DNas-lösning (injektionsflaska 3) sparade i steg 4,4 ovan.
- Kasta bort supernatanten frånde pelleterade cellerna och omedelbart resuspendera cellpelleten i blandningen utspäddes DNas albumin-hämmare.
- Separata intakta celler från cellmembran genom centrifugering genom ett enda steg diskontinuerlig densitetsgradient.
- Förbered diskontinuerlig densitetsgradient genom att lägga till 5 ml albumin-inhibitorlösning (ampull 4) till ett 15 ml rör, och med användning av en 5 ml pipett, försiktigt och långsamt skiktet cellsuspensionen (framställd såsom beskrivits ovan i steg 4,8) ovanpå lösningen albumin-hämmare.
- Centrifugera vid 70 xg under 6 min vid RT.
- Obs: Gränssnittet mellan de två skikten av gradienten bör vara synlig, även om minimal blandning vid denna gräns inte påverkar resultatet. Membranfragment kvar vid gränsytan och dissocierade celler pelle på botten av röret.
- För råttceller, kasta supernatanten och resuspendera cellpelleten i 1 ml rått EFH-medium (förvärmd vid 37 ° C).Räkna levande celltäthet med en hemocytometer och platta celler i en T25 odlingskolv vid en densitet av 10 celler / ul i EFH. Den typiskt utbyte av celler från råttvävnad är ca 2 x 10 6 celler med ca 80% viability.If klonala kulturer önskas, frö celler vid en densitet av mindre än 10 celler / | il. Inkubera kolvarna vid 37 ° C i 5% CO 2 och låta kulturerna växa ostört under en vecka för att undvika aggregation av sfärer.
- För humana celler, kasta supernatanten och resuspendera cellpelleten i 10 ml humant EFH-medium (förvärmd vid 37 ° C). Filtrera cellsuspensionen genom en 40 | im nyloncellfilter följt med 30 ml EFH att avlägsna myelin och cellmembranfragment. Centrifugera vid 300 xg under 5 minuter och resuspendera cellpelleten i 1 ml EFH-medium.
- Räkna levande celltäthet med en hemocytometer och plattan de humana celler i 6-brunnars odlingsplattor vid en densitet av 10 5 celler / brunn i en total volymav 5 ml EFH / brunn. Den typiska utbytet av celler från mänskliga vävnader är ca 1 x 10 6 celler med ca 70% viabilitet. Pre-coat brunnar med en vidhäftande substrat såsom Matrigel (se not nedan). Späd vid ett förhållande av 40 | il Matrigel: 1 ml SFM.
- Obs: Alternativt kan andra vidhäftande substrat såsom poly-D-lysin / laminin, fibronektin eller kollagen användas.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i 5% CO 2 och låta kulturerna växa ostört under en vecka.
5. Aging av vuxna råtta och människa ryggmärgen NSPCs
- Rat NSPCs bildar små neurospheres cirka 70 mikrometer i diameter inom 1 vecka av initial sådd; passagerått NSPCs veckovis genom att samla cellsuspension, centrifugering vid 300 xg under 5 minuter, och mekaniskt finfördelning cellpelleten att dissociera neurosfärerna.
- Seed de dissocierade celler i T25-kolvar som innehåller färsk råtta EFH medium. Alternativtanvända 50% rade rått medium för passage. Den typiska utbytet av rått NSPCs vid passage är ca 5 x 10 6 celler som ökar exponentiellt med passagenummer.
- För mänskliga kulturer, en vecka efter den initiala pläteringen, ersätta hälften av odlingsmediet med färskt EFH två gånger i veckan för att tillåta cellerna att vidhäfta till substratet. I allmänhet 1 - 2 veckor senare när cellerna har fäst vid underlaget, byt ut hela volymen av odlingsmedium två gånger i veckan med färsk EFH.
- Subkultur cellerna innan de når sammanflödet mellan 4-8 veckor.
- Subkultur celler genom att lossa celler från substratet enzymatiskt (se tabell av material) med 2 ml enzym per brunn inkuberades under cirka 10 minuter vid 37 ° C. Samla cellsuspensionen, centrifugera vid 300 xg under 5 minuter, och försiktigt resuspendera cellpelleten i 1 ml nybakade EFH medium.
- Räkna levande celler med en hemocytometer och platta celler i 6-brunnsodlingsplattor (pre-cosom ovan i steg 4,12) vid en densitet av 10 5 celler / brunn i en total volym av 5 ml EFH / brunn ated. Den typiska utbytet av mänskliga NSPCs vid passage är cirka 2 x 10 6 celler och i allmänhet detta kommer att fördubblas med passagen. Generellt upprätthålla kulturer med 50% rade EFH-medium 2 - 3 gånger per vecka mellan passage.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vuxen råtta ryggmärg celler odlade i suspensionskultur i EFH-medium kommer att bilda små neurosfärer (kolonier av odifferentierade celler) inom 1 vecka efter första plätering. I primära kulturer, kommer de flesta av cellerna pläterade dör och tillväxtfaktorkänsliga stamceller kommer proliferera och väljs ut för i EFH mediet. Genom passage 3, kommer det att finnas ett stort antal fritt flytande neurosfärer ca 100 nm i diameter (Figur 2A). Neurosfärer är runda och fas-ljusa och under hög förstoring, är cilier liknande microspikes sett utskjutande från celler på utsidan av sfärer som är karakteristiska för neurosfärer skillnad klumpar av cellrester (Figur 2B). Den typiskt utbyte av celler från råttvävnad är ca 2 x 10 6 celler med omkring 80% viabilitet. Neurosfärerna bör inte ympas på en alltför hög densitet för att undvika aggregation av cellkluster. Även stora neurospheres blivit svårt att skilja och celler blirnekrotisk i mitten av klotet. Detta kommer också att inträffa om kulturer är kvar alltför länge innan passage. I EFH kultur, från vuxen råtta ryggmärgs NSPCs prolifererar (figur 2C) och uttrycker nestin (Figur 2D) en markör för prekursorceller, och låga nivåer av mogna neurala markörer (data ej visade).
Vuxen människa ryggmärgen NSPC kulturer växer inte lika snabbt som rått NSPC kulturer. Om humana ryggmärgen celler initialt odlas i suspension, kommer de att bilda aggregat och oregelbundna kluster av små antal celler i kombination med skräp (Figur 3A). Efterföljande passage av dessa kulturer inte främjar anrikning av NSPC befolkningen. När emellertid de humana cellerna stryks ut i EFH på en vidhäftande monoskikt, de tillväxtfaktorkänsliga NSPCs vidhäftar till substratet (figur 3B) och efterföljande mediautbytes avlägsnar myelin och celldebris (figur 3C). Den typiska utbytet av calnar från mänsklig vävnad är ca 1 x 10 6 celler med ca 70% viabilitet. När de humana NSPC kulturerna blir väl etablerad som en vidhäftande monoskikt, de NSPCs kan då också på platta i suspensionskulturer för att bilda fritt flytande neurosfärer. I EFH kultur, adulta humana ryggmärgen NSPCs prolifererar (figur 3D) och uttrycker nestin (figur 3E) och Sox2 (figur 3F), för en transkriptionsfaktor som visas uttryckas av neurala stamceller, och mycket låga nivåer av mogna neurala markörer (uppgifts visas ej).
Figur 1. Laminektomi av rått ryggmärgen och dissektion av periventrikulär regionen. (A) vid den exponerade caudal slutet av ryggmärgen, är rongeurs införas extradurally i den laterala sidan av ryggradskanalen. (B) Små nedskärningar görs i lamina på varje side av kotorna och lamina försiktigt dras bort för att exponera ryggmärgen. (C) Den exponerade livmoderhalscancer ryggmärgen efter laminektomi. (D) Schematisk bild av bröstkorg ryggraden tvärsnitt visar ryggmärg och placering av nedskärningar för laminektomi (avbildad med röda streckade linjer). Skikten och taggutskottet (skuggade området) tas bort. (E) Ryggmärgen skärs på tvären i 1 cm segment. (F) De överliggande hjärnhinnor, vita substansen, och de flesta av den grå massan avlägsnas försiktigt med hjälp av microscissors. (G ) Köttfärs periventrikulär vävnad. (H) Tvärsnitt av rått ryggmärgen färgades med Luxol snabb blå och hemotoxylin och eosin med streckade linjer visar dissekeras periventrikulär regionen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Vuxen råttryggmärgs NSPCs. (A) genom passagen 3, är ett stort antal neurosfärer ses när råtta ryggmärgs NSPCs odlas i fritt flytande suspensionskultur. (B) Neurosfärer är fas-ljusa och microspikes skjuter ut från neurosfärer (pilar ) är uppenbar vid hög förstoring. (C) dissocieras neurosfärer (passage 3, dag 4) stryks ut på Matrigel-belagda brunnar i EFH-medium, fixerade, och immunfärgades och motfärgades med Hoechst för att visualisera kärnor (blå). I EFH villkor, vuxen råtta ryggmärgs NSPCs föröka (som visas med Ki67 immun) och (D) i första hand uttrycka nestin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
fo: keep-together.within-page = "always"> 
Figur 3. Vuxna humana ryggmärgen NSPCs. (A) När initialt utstrukna i odlingsflaskor, behöver adulta humana ryggmärgen NSPCs inte växa bra. Primära friflytande kulturer i EFH-medium (13 dagar efter plätering) visar aggregat av celler och rester. (B) i motsats härtill i primära vidhäftande kulturer i EFH har NSPCs fäst vid Matrigel-substrat (pilar), som visas vid 17 dagar efter plätering, och (C) vid 41 dagar in vitro. (D) I EFH-medium, adulta humana ryggmärgen NSPCs proliferera, såsom visas med Ki67 immunofärgning (26 dagar in vitro visade), och i första hand uttrycka (E) nestin (26 dagar i vitro visat) och (F) Sox2 (66 dagar in vitro visade). Kärnor motfärgades med Hoechst (blå)./ftp_upload/52732/52732fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under dissektion av råttans ryggmärg försiktighet bör iakttas att inte skada ryggmärgen när de utför laminektomi. Det är lättare att isolera periventrikulär vävnaden när ryggmärgssegmenten är intakta. De vävnadssegment bör vara helt nedsänkt i dissektion buffert och överliggande hjärnhinnor och vit substans kan skäras bort som längsgående remsor med microscissors. Alternativt kan fin vävnad pincett kan användas för att skala den vita substansen bort.
För isoleringsförfarandet för NSPCs använde vi en papain-EDTA-dissociation metod i kombination med mekanisk finfördelning att dissociera råtta och människa ryggmärgsvävnad. Jämfört med andra proteaser, är mindre skadligt men effektiv papain, som tidigare visats med dissociation av postnatal råtta kortikala neuroner 11. Vi fann att dissociering med enbart mekanisk triturering, används ofta med fostervävnad, är inte lika effektiv med vävnad från vuxen. Efter the enzymatisk dissociering, mekanisk triturering är viktigt att bryta upp de återstående vävnadsfragment. Triturering med repetitiva celldispersion med en pipett ska utföras så att det inte finns några kvarvarande intakta vävnadsfragment som resulterar i en grumlig cellsuspensionen. Dock bör triturering inte utföras alltför starkt för att undvika bubbelbildning av cellsuspensionen och resulterande celldöd.
För passage, är råttneurosfärer dissocieras till en enkelcellsuspension via mekanisk finfördelning, såsom beskrevs ursprungligen två. Emellertid kan neurosfärer också dissocieras med användning av enzymatiska metoder, såsom trypsin-EDTA, som inte kommer att skada cellytreceptorer eller stör sfär bildning så länge enzymatisk exponering är kort 12.
Det finns ett antal fördelar med att använda neurosphere analys för kultur NSPCs. Det är relativt enkelt, reproducerbar, och gör det möjligt för den snabba expansionen av neurala stamceller cells 2,12. Men neurospheres är heterogena består främst av progenitorceller som är mer begränsad och endast ett litet antal stamceller. Flera faktorer såsom celltäthet och passaging teknik kan påverka fenotypen av kulturerna, och neurosfärer kan också bilda från progenitorceller 13. Neurosfärer är mycket motila och kan smälta även under betingelser med låg celldensitet 14. Sålunda behöver antalet neurosfärer i odling inte representerar antal stamceller. För att skilja neurala stamceller från progenitorceller bör man använda neural-kolonibildande cellanalys 15,16.
Vuxen råttryggmärgs NSPCs växa samt neurospheres i suspensionskultur i EFH kompletterat medium och är lätt att bygga. Däremot har vi funnit att vuxna människor ryggmärgs NSPCs växa bättre som ett vidhäftande monolager 10. Human Brain-derived neurala stamceller kan upprätthållas på lång sikt i monolager kulture i ett kemiskt definierat medium i närvaro av mitogener som främjar deras fortplantningsförmåga 17,18. Som beskrivits i detta protokoll, kan NSPCs isoleras från vuxen människa ryggmärgen från organtransplanterade donatorer och passerades och utvidgas som en vidhäftande monolager i närvaro av EGF, bFGF och heparin 10. Det är lättare att isolera NSPCs från yngre än äldre donatorer som cellerna växa snabbare, men NSPCs fortfarande kunde isoleras från donatorer upp till vår högsta ålder av 60 år 10. Vi har undersökt en rad olika vidhäftande substrat såsom Matrigel, fibronektin, kollagen typ I, och poly-D-lysin / laminin, och funnit att dessa är effektiva för vidhäftning av vuxen människa ryggmärgen NSPCs 10. Inledningsvis både neurosphere och vidhäftande kulturer innehåller cellulära aggregat, skräp och döda celler. Men detta skräp progressivt avlägsnas med subkultur och tillväxtfaktorn berikade Neurobasal mediet väljer för prolifererande NSPCs. Även skräp och föroreningar myelin kan minskas med noggrann dissektion och borttagning av vit substans från ryggmärgen vävnadssegment. Filtrering av den resulterande cellsuspensionen genom en sil före plätering också bort myelin.
Vi har odlade vuxna mänskliga ryggmärgs NSPCs som vidhäftande monolager för minst 9 månader omfattande cirka 10 passager, men i äldre kulturer finns det en ökad risk för karyotypic avvikelser. Vi utförde karyotype analys på mänskliga NSPCs odlade i 4 månader och hittade en normal diploid karyotyp utan kromosomavvikelser (data visas ej). Vi fann också att celltillväxt och förmåga att differentiera till oligodendrocyter minskade med ökad tid i odling. Till exempel, den relativa andelen O4 positiva celler minskade från 1,3% till 1 månad i kultur till 0,01% efter 4 månader, kultur 10. Både råtta och människa NSPCs är mottagliga för frysförvaring med standard frysning träffadetoder och visar inga signifikanta skillnader i fenotypisk profil.
Isoleringen och utbyggnaden av multi NSPCs i kultur tillåter flera in vitro applikationer, inklusive en undersökning av olika faktorer på vuxna neurala stamceller differentiering. Ökat antal NSPCs kan genereras in vitro och transplanterades in i djurmodeller, såsom ryggmärgsskada, stroke och neurodegenerativa sjukdomar att undersöka det reparativa svaret av dessa neurala stamceller in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1x HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200 mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10,000 U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10 mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100x) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H.
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres--re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, Suppl 1. i112-i120 (2006).
