Isolering af neurale stam- / progenitorceller fra Periventricular Region Adult Rat and Human Spinal Cord
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
Voksne rotte og humane rygmarv neurale stamceller / progenitorceller (NSPC-koder) dyrket i vækstfaktor-beriget medium muliggør spredning af multipotente, selvfornyende og udvides neurale stamceller. I serum- betingelser, vil disse multipotente NSPC-koder differentiere, genererer neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Det høstede væv enzymatisk dissocieret i en papain-EDTA-opløsning og derefter dissocieret mekanisk og adskilles gennem en diskontinuerlig densitetsgradient til opnåelse af en enkelt cellesuspension, som er udpladet i neurobasalt medium suppleret med epidermal vækstfaktor (EGF), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF ) og heparin. Voksen rotte rygmarv NSPC-koder dyrkes som frit svævende neurosfærer og voksne humane rygmarv NSPC-koder dyrkes som vedhængende kulturer. Under disse betingelser, voksne rygmarv NSPC-koder formere, udtrykkelige markører for præcursorceller, og kan løbende udvidet ved passage. Disse celler kan be undersøges in vitro som reaktion på forskellige stimuli, og ydre faktorer kan anvendes til at fremme afstamning begrænsning at undersøge neural stamcelle-differentiering. Multipotent NSPC-koder eller deres afkom kan også transplanteres i forskellige dyremodeller til vurdering regenerativ reparation.
Introduction
NSPC-koder er multipotente celler forpligtet til neurale afstamning, der kan selv forny og let udvide in vitro. Vi henviser til disse celler som en blandet population af neurale stamceller / stamceller, da de viser egenskaber selvfornyende multipotente stamceller og mere begrænsede stamfædre. NSPC-koder findes i både føtale og voksne hjerne og rygmarv 1,2. I den voksne, NSPC-koder normalt hvilende og opholde sig bestemte nicher, herunder subventrikulære zone foring de laterale ventrikler 2-4 og periventricular region omkring centrale kanal af rygmarven 5,6.
Typisk NSPC-koder dyrkes som fritflydende neurosfærer eller som adhærente monolag i serumfrit medium suppleret med EGF og bFGF, mitogener, der udvælger for stamceller / progenitor cellepopulationer. Neurosfæren assay oprindeligt udviklet af Reynolds og Weiss 2, er mest almindeligt anvendt til dyrkning ogudvide neurale stamceller. NSPC-koder viser multipotency når de udplades i vækstfaktor-frit medium indeholdende serum, differentiere til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter. Multipotente kan selvfornyende NSPC-koder isoleres og dyrket fra den voksne gnaver rygmarven når dyrkede væv omfatter områder af central kanal 6,7. En potentiel fordel ved anvendelse NSPC-koder genereret fra den voksne rygmarven i modsætning til generering af celler fra andre regioner er, at disse vævsspecifikke celler mest ligner celler i rygmarven, som er tabt eller beskadiges følgende skade eller sygdom.
Tidligere arbejde har vist, at neurosfærer afledt af voksne mennesker rygmarv ikke kunne opformeres langvarig eller passeret til at generere et tilstrækkeligt antal celler 8,9. Men med modifikationer i dyrkningsbetingelser, vi rapporteret udvidelse og transplantation af voksne humane rygmarvs-afledte NSPC-koder, hvilket viser, at selvfornyendeog multipotente NSPC-koder kan isoleres fra voksne mennesker rygmarv fra organtransplanterede donorer 10. Primært, fjernelse af det meste af den hvide substans under dissektion og dyrkning af disse celler på en adhærent substrat i vækstfaktor-beriget medium valgt til prolifererende voksne humane rygmarv NSPC-koder. I denne protokol beskriver vi høst af rygmarven fra voksne rotter og fra humane organtransplanterede donorer, dissektion af periventricular væv og isolering, kultur og udvidelse af NSPC-koder.
Protocol
Representative Results
Discussion
Under dissektion af rotte rygmarv væv skal sørges for ikke at beskadige rygmarven, mens de udfører laminektomi. Det er lettere at isolere periventricular væv, når rygmarven segmenter er intakte. De vævssegmenter bør være fuldt nedsænket i dissektion buffer og de overliggende meninges og hvid substans kan skæres væk som langsgående strimler med microscissors. Alternativt kan fine væv pincet anvendes til at skrælle den hvide substans væk.
For proceduren for NSPC-koder isolation,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
- Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
- Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
- Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
- Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
- Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
- Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
- Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
- Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
- Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
- Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
- Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
- Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
- Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
- Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).
