Summary

בידוד של תאי גזע / עצביים מהאזור סביב חדרי המוח של העכברוש למבוגרים וחוט השדרה אנושי

Published: May 14, 2015
doi:

Summary

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Abstract

חולדה בוגרת ותאים אנושיים חוט השדרה גזע עצבי / אב (NSPCs) בתרבית בינונית מועשר גורם גדילה מאפשר להתפשטות של multipotent, ותאים עצביים להרחבה עצמי חידוש גזע. בתנאים בסרום, NSPCs multipotent אלה יבדיל, יצירת נוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. הרקמה שנקטפו הוא ניתק אנזימים בפתרון פפאין-EDTA ולאחר מכן ניתקה מכאני ומופרד באמצעות שיפוע צפיפות רציף להניב השעיה תא בודדת שמצופית במדיום Neurobasal בתוספת גורם הגדילה באפידרמיס (EGF), גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF ), והפרין. NSPCs חוט השדרה עכברוש מבוגר בתרבית כריחוף ללא neurospheres וNSPCs חוט השדרה המבוגר אנושי גדלים כמו תרבויות חסיד. בתנאים אלה, NSPCs חוט השדרה המבוגר להתרבות, סמנים מפורשים של תאים מבשר, וניתן להרחיב ברציפות על מעבר. תאים אלה יכולים בהדואר למד במבחנה בתגובה לגירויים שונים, וגורמים חיצוניים ניתן להשתמש כדי לקדם את הגבלת שושלת לבחון התמיינות תאי גזע עצבית. Multipotent NSPCs או צאצאיהם גם ניתן להשתיל לתוך מודלים של בעלי חיים שונים כדי להעריך את תיקון משובי.

Introduction

NSPCs הם תאי multipotent מחויבים לשושלת העצבית שיכול לחדש את עצמו וללא קושי להרחיב במבחנה. אנו מתייחסים לתאים אלה כאוכלוסייה מעורבת של תאי גזע / עצביים שכן הם מציגים את המאפיינים של תאים עצמיים חידוש multipotent גזע ואבות יותר מוגבלים. NSPCs נמצא בשני המוח העוברי ובוגר וחוט השדרה 1,2. במבוגרים, NSPCs הם בדרך כלל שקט ומתגורר בתוך נישות ספציפיות כוללים אזור subventricular המצפה את החדרים לרוחב 2-4, ובאזור סביב חדרי המוח המקיף את התעלה של 5,6 חוט השדרה המרכזית.

בדרך כלל, NSPCs בתרבית כריחוף ללא neurospheres או monolayers חסיד כבמדיום סרום ללא תוספת EGF וbFGF, mitogens שבחרה עבור אוכלוסיות תאי גזע / אב. Assay neurosphere פותח במקור על ידי ריינולדס ווייס 2, הוא נפוץ ביותר לתרבות ולהרחיב תאי גזע עצביים. NSPCs להראות multipotency כאשר הם מצופים בסרום בינוני המכיל ללא גורם גדילה, הבחנה לתוך הנוירונים, האסטרוציטים, וoligodendrocytes. Multipotent, יכול להיות מבודד NSPCs עצמי חידוש ותרבותי מהמכרסמים המבוגרים חוט השדרה כאשר הרקמה התרבותית כוללת אזורים של התעלה המרכזית 6,7. יתרון פוטנציאלי בשימוש NSPCs שנוצר מחוט השדרה המבוגר בניגוד ליצירת תאים מאזורים אחרים הוא שתאי רקמות ספציפיות אלה דומים באופן הדוק ביותר תאים בחוט השדרה שאבדו או ניזוקו בעקבות פציעה או מחלה.

העבודה קודמת הראתה כי neurospheres נגזר מחוט השדרה האדם הבוגר לא יכול להיות מופץ לטווח ארוך או passaged לייצר כמות מספקת של תאי 8,9. עם זאת, עם שינויים בתנאי culturing, שדיווחנו בהרחבה והשתלה של NSPCs נגזר חוט השדרה המבוגר אנושי, הוכחה כי חידוש עצמיויכול להיות מבודד NSPCs multipotent מחוט השדרה האנושי הבוגר של תורמי איברים להשתלה 10. בעיקר, הסרת רוב החומר הלבן בנתיחה וculturing תאים אלה במצע חסיד במדיום מועשר גורם גדילה נבחרה למתרבה NSPCs חוט השדרה האנושי בוגר. בפרוטוקול זה אנו מתארים את הקצירה של חוט השדרה מחולדה בוגרת ומתורמים אדם השתלת איברים, דיסקציה של הרקמה סביב חדרי המוח, ובידוד, התרבות והרחבת NSPCs.

Protocol

נהלי כל החיה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים של רשת הבריאות באוניברסיטה, טורונטו ON קנדה, בהתאם למדיניות שנקבעה במדריך לטיפול והשימוש בבעלי חיים הניסויי שהוכנו על ידי המועצה הקנדית על טיפול בבעלי חיים. לאסיף רקמת חוט השדרה אנושית, התקבל אישור מרשת בריאות אוניברסי?…

Representative Results

תאי חוט השדרה עכברוש מבוגר גדלו בתרבות השעיה במדיום EFH יהוו neurospheres הקטן (מושבות של תאים שלא עברו התמיינות) בתוך השבוע של ציפוי ראשוני 1. בתרבויות עיקריות, רוב התאים מצופים ימותו ותאי גזע גורם מגיב צמיחה יתרבו ונבחרו במדיום EFH. על ידי מעבר 3, יהיה ריחוף ללא neurospheres רב כ -100 מ…

Discussion

במהלך הנתיחה של טיפול רקמות חוט השדרה העכברוש יש לנקוט לא לפגוע בחוט השדרה בעת ביצוע laminectomy. קל יותר לבודד את הרקמות סביב חדרי המוח כאשר מגזרי חוט השדרה הם בשלמותה. מגזרי הרקמה צריכים להיות שקועים לחלוטין במאגר לנתיחה וניתן לחתוך את קרומי המוח שמעל וחומר לבן כרצועות א…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Materials

1X PBS Life Technologies #10010023 Dissection buffer
1X HBSS Life Technologies #14175095 Dissection buffer
D-glucose Sigma # G-6152 Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140-148 Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A  Life Technologies #10888-022 Culture medium
L-glutamine, 200mM Life Technologies #25030-081 Culture medium
B27 Life Technologies #12587010 Culture medium
DMEM Life Technologies #11885084 Hormone mix
F12 Life Technologies #21700-075 Hormone mix
NaHCO3 Sigma # S-5761 Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES Sigma #H9136 Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin Sigma #I-5500 Hormone mix
Apo-transferrin Sigma #T-2252 Hormone mix
Putrescine Sigma # P7505 Hormone mix
Selenium Sigma #S-9133 Hormone mix
Progesterone Sigma #P-6149 Hormone mix
EGF, mouse Sigma #E4127 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant Sigma #E9644 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant Sigma #F0291 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium 
Heparin, 10000U Sigma #H3149 Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit Worthington Biochemicals #LK003150 Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital Bimeda – MTC Animal Health Inc DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons Fine Science Tools #11006-12  Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4 Fine Science Tools #11241-30
Microscissors Fine Science Tools #15024-10 Round-handled Vannas
Rongeurs Bausch & Lomb N1430
10mm Petri dishes  Nunc 1501
T25 Culture flasks Nunc 156367
40 μm nylon cell strainer VWR CA21008-949
6 well plates Nunc CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100X) Corning 354230 Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

References

  1. Gage, F. H. Mammalian neural stem cells. Science. 287, 1433-1438 (2000).
  2. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  3. Gritti, A., et al. Multipotential stem cells from the adult mouse brain proliferate and self-renew in response to basic fibroblast growth factor. J Neurosci. 16, 1091-1100 (1996).
  4. Morshead, C. M., et al. Neural stem cells in the adult mammalian forebrain: a relatively quiescent subpopulation of subependymal cells. Neuron. 13, 1071-1082 (1994).
  5. Weiss, S., et al. Multipotent CNS stem cells are present in the adult mammalian spinal cord and ventricular neuroaxis. J Neurosci. 16, 7599-7609 (1996).
  6. Martens, D. J., Seaberg, R. M., van der Kooy, D. In vivo infusions of exogenous growth factors into the fourth ventricle of the adult mouse brain increase the proliferation of neural progenitors around the fourth ventricle and the central canal of the spinal cord. Eur J Neurosci. 16, 1045-1057 (2002).
  7. Kulbatski, I., et al. Oligodendrocytes and radial glia derived from adult rat spinal cord progenitors: morphological and immunocytochemical characterization. J Histochem Cytochem. 55, 209-222 (2007).
  8. Akesson, E., et al. Long-term culture and neuronal survival after intraspinal transplantation of human spinal cord-derived neurospheres. Physiol Behav. 92, 60-66 (2007).
  9. Dromard, C., et al. Adult human spinal cord harbors neural precursor cells that generate neurons and glial cells in vitro. J Neurosci Res. 86, 1916-1926 (2008).
  10. Mothe, A. J., Zahir, T., Santaguida, C., Cook, D., Tator, C. H. Neural stem/progenitor cells from the adult human spinal cord are multipotent and self-renewing and differentiate after transplantation. PLoS One. 6, e27079 (2011).
  11. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
  12. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and expansion of the adult mouse neural stem cells using the neurosphere assay. J Vis Exp. , (2010).
  13. Reynolds, B. A., Rietze, R. L. Neural stem cells and neurospheres–re-evaluating the relationship. Nat Methods. 2, 333-336 (2005).
  14. Singec, I., et al. Defining the actual sensitivity and specificity of the neurosphere assay in stem cell biology. Nat Methods. 3, 801-806 (2006).
  15. Louis, S. A., Azari, H., Sharififar, S., Vedam-Mai, V., Reynolds, B. A. Neural-colony forming cell assay: an assay to discriminate bona fide neural stem cells from neural progenitor cells. J Vis Exp. , (2011).
  16. Louis, S. A., et al. Enumeration of neural stem and progenitor cells in the neural colony-forming cell assay. Stem Cells. 26, 988-996 (2008).
  17. Conti, L., et al. Niche-independent symmetrical self-renewal of a mammalian tissue stem cell. PLoS Biol. 3, e10 (2005).
  18. Pollard, S. M., Conti, L., Sun, Y., Goffredo, D., Smith, A. Adherent neural stem (NS) cells from fetal and adult forebrain. Cereb Cortex. 16, i112-i120 (2006).

Play Video

Cite This Article
Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (99), e52732, doi:10.3791/52732 (2015).

View Video