Summary

Isolierung von Neural Stamm- / Vorläuferzellen aus dem Periventrikuläre Region der erwachsenen Ratte und Human Spinal Cord

Published: May 14, 2015
doi:

Summary

The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.

Abstract

Erwachsenen Ratte und menschlichen Rückenmarks neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen (NSPC) in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium kultiviert ermöglicht die Proliferation von multipotenten, selbst erneuernden und erweiterbar neuralen Stammzellen. Im Serum Bedingungen wird diese multi NSPC unterscheiden, Erzeugen Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Das geerntete Gewebe wird enzymatisch in einer Papain-EDTA-Lösung dissoziiert und dann mechanisch dissoziiert und in einem diskontinuierlichen Dichtegradienten getrennt, um eine Einzelzellsuspension, die in Neurobasalmedium mit dem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor plattierende Ausbeute (bFGF ) und Heparin. Erwachsenen Ratte Rückenmark NSPC sind als freischwebende Neurosphären und menschlichen Rückenmark NSPC Erwachsenen kultiviert werden als adhärente Kulturen angebaut. Unter diesen Bedingungen Erwachsenen Rückenmarks NSPC proliferieren express Marker von Vorläuferzellen, und kann kontinuierlich beim Durchgang ausgedehnt werden. Diese Zellen können be suchten in vitro als Reaktion auf verschiedene Reize, und exogene Faktoren können verwendet werden, um Linienbeschränkung zu fördern, um neuronale Stammzelldifferenzierung zu untersuchen. Multi NSPC oder deren Nachkommen können auch in verschiedenen Tiermodellen transplantiert werden, um Wiederaufbaureparatur zu bewerten.

Introduction

NSPC sind multipotente Zellen in das neuronale Abstammungslinie, die sich selbst erneuern kann und leicht in vitro auszuweiten. Wir bezeichnen diese Zellen als eine gemischte Population von neuralen Stammzellen / Vorläuferzellen, da sie Eigenschaften von sich selbst erneuernden multipotenten Stammzellen und Vorläuferzellen beschränkt anzuzeigen. NSPC sowohl in der fötalen und adulten Gehirn und Rückenmark 1,2 gefunden. Beim Erwachsenen sind NSPC normale ruhende und aufzuhalten, in bestimmten Nischen einschließlich der Subventrikularzone entlang der Seitenventrikel 2-4, und der periventrikulären Region um den Zentralkanal des Rückenmarks 5,6.

Typischerweise werden NSPC als freischwebende Neurosphären oder als adhärente Monolagen in serumfreien Medium mit EGF und bFGF supplementiert, Mitogene, die für die Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen durch kultiviert. Neurosphäre Assay ursprünglich von Reynolds und Weiss 2 entwickelt, wird am häufigsten verwendet, und die KulturErweitern neuralen Stammzellen. NSPC zeigen Multipotenz, wenn sie in Wachstumsfaktor-haltigen serumfreien Medium ausplattiert, sich in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Multi kann selbst erneuernden NSPC isoliert und kultiviert werden vom erwachsenen Nager Rückenmarks, wenn das gezüchtete Gewebe umfasst Regionen des Zentralkanals 6,7. Ein potentieller Vorteil der Verwendung NSPC des Erwachsenen Rückenmark und nicht zur Erstellung Zellen aus anderen Regionen erzeugt ist, dass diese gewebespezifischen Zellen am ähnlichsten Zellen im Rückenmark, die verloren gehen oder beschädigt werden, nach einer Verletzung oder Krankheit.

Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass Neurosphären aus adulten menschlichen Rückenmark abgeleiteten nicht langfristig vermehrt oder passagiert, um eine ausreichende Anzahl von Zellen 8,9 erzeugen. Jedoch mit Modifikationen in Kultivierungsbedingungen berichteten wir über die Ausdehnung und die Transplantation von adulten menschlichen Rückenmark stamm NSPC, was zeigt, dass selbst erneuerndenund multi NSPC aus erwachsenen menschlichen Rückenmark von Organtransplantation Spender 10 isoliert werden. In erster Linie die Entfernung des größten Teils der weißen Substanz bei der Präparation und Kultivierung dieser Zellen auf einem haftenden Substrat in Wachstumsfaktor-angereicherten Medium für proliferierende menschliche Wirbelsäule NSPC Erwachsenen gewählt. In diesem Protokoll beschreiben wir die Ernte des Rückenmarks von erwachsenen Ratte und aus menschlichen Organtransplantation Spender, Dissektion der periventrikuläre Gewebe und der Isolierung, der Kultur und den Ausbau der NSPC.

Protocol

Alle Tierverfahren werden von der Animal Care Committee der Universität Health Network, Toronto ON Kanada zugelassen, in Übereinstimmung mit den Richtlinien im Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durch die Canadian Council on Animal Care vorbereitet etabliert. Für die Ernte der menschlichen Rückenmarksgewebe, wurde die Genehmigung der University Health Network Research Ethics Verwaltungsrat und von der Trillium-Gift of Life Foundation, die Organspende in Ontario, Kanada beaufsichtigt erhalten…

Representative Results

Erwachsenen Ratte Rückenmark-Zellen in Suspensionskultur in EFH Medium gezüchtet werden kleine Neurosphären (Kolonien von undifferenzierten Zellen) innerhalb 1 Woche nach anfänglichen Plattierung zu bilden. In Primärkulturen, die meisten Zellen ausplattiert sterben und Wachstumsfaktor-responsive Stammzellen proliferieren und werden in der EFH Medium ausgewählt. Durch den Durchgang 3, wird es zahlreiche frei schwebenden Neurosphären etwa 100 & mgr; m im Durchmesser (2A) sein. Neurospheres sind…

Discussion

Während der Präparation des Rattenrückenmarksgewebe sollte darauf geachtet nicht zu beschädigen das Rückenmark während der Durchführung der Laminektomie werden. Es ist einfacher, die periventricular Gewebe zu isolieren, wenn die Rückenmarksegmente intakt sind. Die Gewebesegmente sollten in Dissektion Puffer vollständig eingetaucht werden, und die darüberliegenden Hirnhaut und weißen Substanz weg als Längsstreifen mit Mikroschere geschnitten werden. Alternativ können feine Gewebe-Zange benutzt, um die weiße…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.

Materials

1X PBS Life Technologies #10010023 Dissection buffer
1X HBSS Life Technologies #14175095 Dissection buffer
D-glucose Sigma # G-6152 Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix
Penicillin-Streptomycin Life Technologies #15140-148 Dissection buffer and culture medium
Neurobasal-A  Life Technologies #10888-022 Culture medium
L-glutamine, 200mM Life Technologies #25030-081 Culture medium
B27 Life Technologies #12587010 Culture medium
DMEM Life Technologies #11885084 Hormone mix
F12 Life Technologies #21700-075 Hormone mix
NaHCO3 Sigma # S-5761 Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix
HEPES Sigma #H9136 Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix
Insulin Sigma #I-5500 Hormone mix
Apo-transferrin Sigma #T-2252 Hormone mix
Putrescine Sigma # P7505 Hormone mix
Selenium Sigma #S-9133 Hormone mix
Progesterone Sigma #P-6149 Hormone mix
EGF, mouse Sigma #E4127 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
EGF, human recombinant Sigma #E9644 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium
bFGF, human recombinant Sigma #F0291 Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium 
Heparin, 10000U Sigma #H3149 Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium
Papain dissociation kit Worthington Biochemicals #LK003150 Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA
Sodium Pentobarbital Bimeda – MTC Animal Health Inc DIN 00141704
Tissue Forceps: Addisons Fine Science Tools #11006-12  Serrated standard tip; micro-tip also available
Fine Forceps: Dumont #4 Fine Science Tools #11241-30
Microscissors Fine Science Tools #15024-10 Round-handled Vannas
Rongeurs Bausch & Lomb N1430
10mm Petri dishes  Nunc 1501
T25 Culture flasks Nunc 156367
40 μm nylon cell strainer VWR CA21008-949
6 well plates Nunc CA73520-906
Matrigel, growth factor reduced (100X) Corning 354230 Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM

References

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Cite This Article
Mothe, A., Tator, C. H. Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord. J. Vis. Exp. (99), e52732, doi:10.3791/52732 (2015).

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