成体ラットおよびヒト脊髄の脳室周囲領域から神経幹/前駆細胞の単離
Summary
The adult mammalian spinal cord contains neural stem/progenitor cells (NSPCs) that can be isolated and expanded in culture. This protocol describes the harvesting, isolation, culture, and passaging of NSPCs generated from the periventricular region of the adult spinal cord from the rat and from human organ transplant donors.
Abstract
成体ラットおよび増殖因子に富む培地中で培養したヒト脊髄神経幹/前駆細胞（NSPCs）は、自己再生、及び拡張可能な神経幹細胞の多能性の増殖を可能にします。血清条件では、これらの多能NSPCsは、ニューロン、星状細胞、およびオリゴデンドロサイトを生成し、差別化されます。採取した組織は、酵素パパイン-EDTA溶液中で解離した後、機械的に上皮成長因子（EGF）を補充した神経基礎培地中に播種された単一細胞懸濁液を、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGFを得るために、不連続密度勾配を介して分離し、分離されています）、およびヘパリン。成体ラットの脊髄NSPCsは、接着培養として成長させた自由浮動ニューロスフェアと成人の脊髄NSPCsとして培養されます。これらの条件下では、成人脊髄NSPCsは、前駆細胞のマーカーを発現し、増殖し、連続的に通過時に拡張することができます。これらの細胞は、bはできeは、様々な刺激に応答してインビトロで研究され、外因性因子は、神経幹細胞の分化を調べるために系統限定を促進するために使用することができます。多能NSPCsまたはそれらの子孫はまた、再生修復を評価するために種々の動物モデルに移植することができます。
Introduction
NSPCsは自己更新し、容易にin vitroで拡大することができる神経系統にコミット多能性細胞です。彼らは自己複製多能性幹細胞、より制限された前駆細胞のプロパティを表示するので、我々は、神経幹/前駆細胞の混合集団として、これらの細胞を指します。 NSPCsは胎児および成人の脳と脊髄の1,2の両方で発見されています。成人では、NSPCsは通常、静止状態であり、側脳室2-4を裏打ちする脳室下帯、及び脊髄5,6の中心管の周囲の脳室周囲領域を含む特定のニッチ内に存在します。
一般的に、NSPCsは、EGFおよびbFGFを添加した無血清培地中で自由に浮遊ニューロスフェアとして、または接着性単層、幹細胞/前駆細胞集団を選択マイトジェンとして培養されます。もともとレイノルズとワイス2によって開発されたニューロスフェアアッセイは、最も一般的に培養するために使用され、神経幹細胞を展開します。それらは血清を含む成長因子を含まない培地にプレーティングされている場合NSPCsは、ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイトに分化、多分化を示します。培養組織は、中心管6,7の領域を含む場合には、多能、自己複製NSPCsは、成体齧歯類脊髄から単離し、培養することができます。他の地域からの細胞を生成するのではなく、成人の脊髄から生成NSPCsを使用する際の潜在的な利点は、これらの組織特異的細胞が最も密接に損傷または疾患、次の紛失または損傷した脊髄の細胞に似ているということです。
以前の研究は、成人の脊髄から派生した神経球は、長期的に伝播またはセル8,9の十分な数を生成するために、継代することができなかったことを示しました。しかし、培養条件の変更を加えて、我々は、その自己再生を実証、成人の脊髄由来NSPCsの拡大と移植を報告しましたそして多能NSPCsは臓器移植ドナー10の成人の脊髄から単離することができます。主に、解剖時の白質の大部分を除去し、成人脊髄NSPCsの増殖のために選択され、増殖因子に富む培地中で接着性基板上にこれらの細胞を培養します。このプロトコルでは、成体ラットからと人間の臓器移植ドナーからの脊髄の収穫、脳室周囲組織の切開、および分離、文化、NSPCsの拡張について説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ラットの脊髄組織のケアの解剖時の椎弓切除を行いながら、脊髄を損傷しないように注意してください。これは、脊髄セグメントが完全であるときに脳室周囲の組織を分離する方が簡単です。組織セグメントは、完全に解剖バッファーに浸漬する必要があり、上に髄膜および白質はmicroscissorsと縦ストリップとして離れて切断することができます。また、微細な組織鉗子離れ白質を剥離するた…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge support from Spinal Cord Injury Ontario, the Ontario-China Research and Innovation Fund, the Toronto General and Western Hospital Foundation, and Physicians’ Services Incorporated Foundation. The authors thank Dr. Tasneem Zahir for expert advice in human spinal cord NSPC culture, and Drs. Cindi Morshead and Iris Kulbatski for their expert advice in rat spinal cord NSPC isolation.
Materials
| 1X PBS | Life Technologies | #10010023 | Dissection buffer |
| 1X HBSS | Life Technologies | #14175095 | Dissection buffer |
| D-glucose | Sigma | # G-6152 | Prepare 30% glucose stock solution for dissection buffer and hormone mix |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | #15140-148 | Dissection buffer and culture medium |
| Neurobasal-A | Life Technologies | #10888-022 | Culture medium |
| L-glutamine, 200mM | Life Technologies | #25030-081 | Culture medium |
| B27 | Life Technologies | #12587010 | Culture medium |
| DMEM | Life Technologies | #11885084 | Hormone mix |
| F12 | Life Technologies | #21700-075 | Hormone mix |
| NaHCO3 | Sigma | # S-5761 | Prepare 7.5% NaHCO3 stock solution for hormone mix |
| HEPES | Sigma | #H9136 | Prepare 1M HEPES stock solution for hormone mix |
| Insulin | Sigma | #I-5500 | Hormone mix |
| Apo-transferrin | Sigma | #T-2252 | Hormone mix |
| Putrescine | Sigma | # P7505 | Hormone mix |
| Selenium | Sigma | #S-9133 | Hormone mix |
| Progesterone | Sigma | #P-6149 | Hormone mix |
| EGF, mouse | Sigma | #E4127 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| EGF, human recombinant | Sigma | #E9644 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| bFGF, human recombinant | Sigma | #F0291 | Prepare 100 μg/ml stocks in B27 and aliquot; EFH medium |
| Heparin, 10000U | Sigma | #H3149 | Prepare 27.3 mg/ml stocks in hormone mix and aliquot; EFH medium |
| Papain dissociation kit | Worthington Biochemicals | #LK003150 | Contains EBSS, papain, DNase, ovomucoid protease inhibitor with BSA |
| Sodium Pentobarbital | Bimeda – MTC Animal Health Inc | DIN 00141704 | |
| Tissue Forceps: Addisons | Fine Science Tools | #11006-12 | Serrated standard tip; micro-tip also available |
| Fine Forceps: Dumont #4 | Fine Science Tools | #11241-30 | |
| Microscissors | Fine Science Tools | #15024-10 | Round-handled Vannas |
| Rongeurs | Bausch & Lomb | N1430 | |
| 10mm Petri dishes | Nunc | 1501 | |
| T25 Culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 40 μm nylon cell strainer | VWR | CA21008-949 | |
| 6 well plates | Nunc | CA73520-906 | |
| Matrigel, growth factor reduced (100X) | Corning | 354230 | Thaw according to directions and freeze aliquots; use diluted at a ratio of 40 μl Matrigel: 1 ml SFM |
References
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