Here the method to establish a syngeneic mouse model of orthotopic bladder tumour to evaluate the anti-tumour efficacy of the bacterial protein HP-NAP is described.
Bladder cancer is one of the most common malignancies of the urogenital tract. Intravesical injection of Bacillus Calmette-Guérin (BCG) is the gold standard treatment for the high-grade non-muscle invasive bladder cancer (NMIBC). However, since the treatment-related side effects are relevant, newer biological response modifiers with a better benefit/side effects ratio are needed.
The tumour microenvironment can influence both tumour development and therapy efficacy. In order to obtain a good model, it is desirable to implant tumour cells in the organ from which the cancer originates.
In this protocol, we describe a method for establishing a tumour in the bladder cavity of female mice and subsequent delivery of therapeutic agents; the latter are exemplified by our use of Helicobacter pylori neutrophil activating protein (HP-NAP). A preliminary chemical burn of the mucosa, followed by the injection of mouse urothelial carcinoma cell line MB49 via urethral catheterization, enables the cells to attach to the bladder mucosa. After a period, required to allow an initial proliferation of the cells, mice are treated with HP-NAP, administrated again via catheterization. The anti-tumour activity of HP-NAP is evaluated comparing the tumour volume, the extent of necrosis and the degree of vascularization between vehicle- and HP-NAP-treated animals.
Blærekræft er en af de mest almindelige kræft i urogenitalkanalen, med næsten 75.000 nye tilfælde hvert år i USA 1. Høje tilbagefald kræver livslang opfølgning, hvilket gør blærekræft en af de dyreste kræftformer at behandle. Guldstandarden behandling for høj kvalitet NMIBC er trans-urethral resektion efterfulgt af intravesikal immunterapi med BCG. Selvom den præcise mekanisme af anti-tumor aktiviteten af BCG stadig at blive fuldstændigt belyst, er det accepteret, at aktiveringen af en immunreaktion cellemedieret beriget i T hjælper (Th) 1 og cytotoksisk T (Tc) 1-celler er afgørende for succesen af terapien 2.
På trods af at BCG fortsat behandling af valg for NMIBC, en stor del af patienterne responderer ikke på behandlingen; endvidere kan det medføre en række bivirkninger: ca. 70% af de behandlede tumorer igen efter nogen tid og ~ 15% fremskridt til muskel-invasive form forsygdom. Andre bivirkninger forbundet med BCG behandling indbefatter dysuri, blærebetændelse og nyre-infektion 3-6.
Udviklingen af nye terapeutiske strategier skal tage hensyn til brugen af prækliniske modeller, efter indledende in vitro evaluering; Dette er særlig relevant i tumorer, hvis mikromiljø kan væsentligt påvirke deres udvikling og lydhørhed over for behandling.
I det seneste årti har vi behandlet flere aspekter af den immunmodulerende aktivitet af HP-NAP, et protein produceret af bakterien Helicobacter pylori, oprindeligt identificeret som stand til at fremme endothelial adhæsion af polymorfkernede celler (PMN'er) 7. Strukturelt HP-NAP tilhører DNA-beskyttende protein under udsultede forhold (DPS) familie 8 og består af 12 identiske underenheder arrangeret i en dodecameric skal.
Vi har vist, at HP-NAP eren Toll-lignende receptor (TLR) 2 agonist, med en stærk immuno-modulerende aktivitet ansvarlig for at drive differentieringen af T-lymfocytter mod Th1-fænotype, både in vitro og in vivo 9-10. I kraft af denne aktivitet, HP-NAP er i stand til at omdirigere immunreaktionen Th2 til det mere fordelagtigt Th1-respons i en murin model for allergisk astma 11.
At evaluere Th1-afhængige anti-tumor potentiale HP-NAP, tog vi fordel af en musemodel for blærekræft udviklet flere år siden af O'Donnel og kolleger 12 til evaluering af virkningen af BCG administration.
Med denne protokol, viser vi, at HP-NAP har en stærk anti-tumor potentiale mod blærecancer og at effektiviteten af HP-NAP administration parallelt med signifikant akkumulering, inden tumor og regionale lymfeknuder, af både Th1 og TC1 lymfocytter producerer Interferon ( IFN) -γ 13 </sup>. Tumorer isoleret fra HP-NAP-behandlede mus viste mere nekrose og mindre vaskularisering end den ubehandlede modpart.
Nærværende rapport giver en skridtvise protokol beskriver udarbejdelsen af dyrene, deres urethral kateterisation, den kemiske brændende kræves til fastgørelse af celler til blæren slimhinde, og injektion af tumorcellerne. Vi beskriver også den topiske administration af HP-NAP, der kan betragtes som en prototype på nogen terapeutiske midler, der er udviklet til behandling af blærecancer. De beviser opnået ved at sammenligne tumorer isoleret fra kontrol og HP-NAP-behandlede dyr fremhæver ikke kun det faktum, at HP-NAP kunne være en god kandidat til blærekræft immunterapi, men også den generelle effektivitet i den eksperimentelle oprettet.
Hovedparten af fremskridt i cancerbehandling forlange afprøvninger i dyremodeller, før du starter kliniske forsøg. Muligheden for at studere tumor biologi in vivo, at drage fordel af dyremodeller, er et afgørende redskab for forskere undersøger kræft patogenese, der gør det muligt at vurdere de forskellige behandlingsmetoder. Orthotopisk modeller forbliver guldstandarden 14-15, både på grund af den enorme mængde af cellelinier til rådighed til at oprette en tumor model, og fordi de e…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro, italienske universiteter og forskning, Prin-projekter og Progetti di Ricerca di Ateneo indrømme N ° CPDA137871, Fondazione Cariplo yde N ° 2011-0485 til mdb, og ved Finanziamento Giovani Studiosi, University of Padua, til Gaia Codolo.
Materials | |||
C57BL/6J female mice | Harlan Italy (Udine, Italy) | ||
MB49 Cells | Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA | ||
RPMI | Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) | R8758 | |
FBS | Sigma-Aldrich | F7524 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X, to be diluted in apyrogenic water |
Flask | Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) | 353135 | |
Syringe 1ml | Becton Dickinson | 301358 | |
Trypsin | Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) | ||
Gentamycin | Life Technologies | 15710-049 | |
Xilor | Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) | 2% Xylazin | |
Zoletil | Virbac (Carros, France) | 359713301992 | 5% Zolazepam + 5% Tiletamine |
24G Catheter | Terumo (Rome, Italy) | SR+DM2419PX | |
HCl | Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) | 403871 | Liquid |
NaOH | JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) | 10095011 | Powder |
Equipment | |||
Surgical Scalpel | Albion Surgical Limited (Sheffield, England) | ||
Microtome | Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) | RM2235 | |
Microscope Slides | VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) | 631-0108 | |
Image Analyzer | Zeiss (Jena, Germany) | Cyres System |
Materials C57BL/6J female mice Harlan Italy (Udine, Italy) MB49 Cells Obtained from Prof. O'Donnel, University of Iowa Carver College of Medicine, Iowa, USA RPMI Sigma-Aldrich (St. Louis, Missouri, USA) R8758 FBS Sigma-Aldrich F7524 PBS Sigma-Aldrich D1408 10X, to be diluted in apyrogenic water Flask Becton Dickinson (Franklin Lakes, New Jersey, USA) 353135 Syringe 1ml Becton Dickinson 301358 Trypsin Life Technologies (Waltham, Massachusetts, USA) Gentamycin Life Technologies 15710-049 Xilor Bio 98 s.r.l. (Milano, Italy) 2% Xylazin Zoletil Virbac (Carros, France) 359713301992 5% Zolazepam + 5% Tiletamine 24G Catheter Terumo (Rome, Italy) SR+DM2419PX HCl Carlo Erba Reagents (Milano, Italy) 403871 Liquid NaOH JT Baker (Center Valley, Pennsylvania, USA) 10095011 Powder Equipment Surgical Scalpel Albion Surgical Limited (Sheffield, England) Microtome Leica Microsystem ( Wetzlar, Germany) RM2235 Microscope Slides VWR International (Radnor, Pennsylvania, USA) 631-0108 Image Analyzer Zeiss (Jena, Germany) Cyres System