استخدام نظام تيتون لدراسة الآليات الجزيئية لتجديد الزرد
Summary
Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.
Abstract
The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.
Introduction
الزرد هو كائن نموذج الفقاريات راسخة لدراسة العديد من جوانب التنمية، علم وظائف الأعضاء، والمرض، وتجديد. مع اعتماد متزايد من الزرد كنموذج للعمليات البيولوجية بعد الجنينية، والأدوات التجريبية للمحرض، والتلاعب الأنسجة محددة التعبير الجيني أو مسارات الإشارات أصبحت ذات أهمية متزايدة. بشكل خاص، عانت الدراسات إلى الجهاز وتجديد أطرافهم في الزرد الكبار من عدم وجود أدوات للتشريح من المتطلبات المكانية والزمانية لمسارات الإشارات خلال هذه العمليات التجدد.
حاليا، وقد استخدمت ثلاثة أنظمة مختلفة لتحقيق المشروط، الأنسجة محددة التعبير الجيني في تجديد أجهزة الزرد الكبار: نظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، والتعبير فسيفساء من حرارة صدمة الجينات المحورة محرض باستخدام بوساطة ينقول transgenesis الجسدية، ونظام تيتون 1 -3. تيتون يشير إلى متغير من التتراسيكلين-تابعتوالت نظام تفعيل النسخي، حيث يتم تنشيط التعبير في وجود المضادات الحيوية التتراسيكلين أو مشتق، على سبيل المثال الدوكسيسيكلين. نظام جنة المساواة العرقية، السلمون المدخن، حيث تم حتى الآن استخدامها في الأسماك البالغة، يعتمد على لجنة المساواة العرقية recombinase تسيطر تاموكسيفين (CreERT2)، الذي يقتصر مكانيا من قبل عناصر تنظيمية الأنسجة محددة التعبير. إزالة لجنة المساواة العرقية يحركها من شريط إيقاف تسهل التعبير عن الجينات في المصالح يقودها المروج التي يجب أن تكون نشطة في جميع أنواع الخلايا 1. إنشاء بوساطة ينقول من الجينات المحورة جسدية أعرب mosaically يوفر نظام لمحرض التعبير التحوير في الأنساب الخلية الفردية. حقن الأجنة الزرد مع ينقول Tol2 يحمل الجين من الفائدة تحت السيطرة النسخي من الصدمة الحرارية النتائج المروج في الأفراد خيالية تحمل عادة التحوير فقط في الأنساب خلية منفصلة من جهاز تجديد 2. في حين أن كلا المنظومتين تتيح للالمشروط الأنسجة جمعية مهندسي البترولcific التعبير الجيني، ونظام لجنة المساواة العرقية، السلمون المدخن لا يمكن عكسها، واستراتيجية باستخدام القائم على ينقول وضع العلامات نسيلي يعاني من طبيعتها العشوائية. وبالتالي، نحن وغيرنا لقد تأقلم مؤخرا أنظمة تيتون المعدلة وراثيا لاستخدامها في الزرد، والتي تسهل زمانيا ومكانيا التعبير الجيني للرقابة التي بالإضافة الانضباطي وعكسها 3-5.
يتألف نظام تيتون المستخدمة هنا خط سائق المعدلة وراثيا (TetActivator) فيه دوكسي (DOX) المنشط النسخي -inducible (تحسين transactivator التتراسيكلين العكسي، irtTA، باختصار تيتا) هو تحت سيطرة تسلسل الجينوم التنظيمية الأنسجة محددة. ثانيا، فإنه يتطلب خط الرد المعدلة وراثيا (TetResponder) التي تؤوي الجين من الفائدة تحت السيطرة النسخي المشغل التتراسيكلين (عنصر استجابة تيت؛ TetRE) (الشكل 1A). وهكذا، واستخدام مجموعات محددة من TetActivator وTetResponder خطوط يسمح للالمشروط الأنسجة SPECIالتلاعب المرورية في التعبير الجيني.
لقد استخدمت مؤخرا نظام تيتون للتحقيق لوظائف الأنسجة محددة من WNT / بيتا catenin الإشارات في الكبار تجديد الذيل الزعنفة الزرد 3. في البروتوكول المذكورة هنا نحن تصف تدفق العمل لانشاء واستخدام نظام تيتون في الزرد، ولا سيما بالنسبة للدراسات تجديد الزعانف. هذا يتضمن تعليمات مفصلة حول كيفية توليد TetActivator وTetResponder خطوط المعدلة وراثيا مستقرة وبروتوكول لتحريض التحوير في الأجنة والزرد الكبار. وعلاوة على ذلك، وصفنا تقنيات للتحقق من الأنسجة محددة التعبير الجيني في تجديد الزعانف، بما في ذلك بروتوكول لإعداد cryosections زعانف الزرد الكبار. بالإضافة إلى ذلك، نحن نناقش اعتبارات لتصميم التحوير TetActivator، واختيار طريقة transgenesis، والكشف عن TetResponder التعبير. وبالتالي، فإن الهدف العام من هذا البروتوكول هو بمثابة مخططلوضع المتابعة نظام تيتون وظيفية في الزرد لتحقيق المشروط الأنسجة محددة التعبير الجيني، والتي يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنسجة في المصالح.
أنشأنا ناقلات TetActivator السماح لI-SCEI أو الجيل Tol2 بوساطة خطوط TetActivator مستقرة باستخدام قصيرة تسلسل الجينوم التنظيمية (شظايا محسن؛ Weidinger مختبر قاعدة البيانات البلازميد أي 1247؛ الشكل 1B). يحتوي هذا البناء الكاسيت TetActivator تتكون من البديل متحولة M2 من العكسي تيت مجال كاظمة تنصهر مع فيروس الهربس البسيط VP16 transactivation مجال مشتقة 3F [irtTAM2 (3F)]. التعبير عن TetActivator (تيتا) يمكن رصدها بسهولة لأنها مع AmCyan fluorophore من نفس إطار القراءة المفتوح أعرب المشارك؛ الببتيد P2A يتوسط الريباسي الطفر، والتي ينبغي أن يؤدي إلى إنتاج تيتا وAmCyan كما البروتينات منفصلة في نسبة 1: 1 5،6. يحتوي بناء أيضا poylinker 5 'من TetActivator كاسيت لتسهيل إدراج تسلسل الجينوم التنظيمية ذات الاهتمام باستخدام أساليب الاستنساخ التقليدية.
بالإضافة إلى ذلك، أنشأنا بناء تتكون من الكاسيت أعلاه وصف TetActivator بالإضافة إلى مجموعة كاسيت كانامايسين (Weidinger قاعدة البيانات البلازميد مختبر أي 1180؛ الشكل 1C)، والتي يمكن معاد في الكروموسوم الاصطناعي البكتيري (BAC) تحتوي على منطقة الجينومية كبيرة ( عادة في كودون بداية الجين الذي التعبير النمط أن يحاكي قبل التحوير). تتوفر كل من يبني من المختبر Weidinger بناء على طلبها.
Protocol
Representative Results
Discussion
الزرد الكبار لديه قدرة مذهلة على تجديد العديد من الأعضاء الداخلية والزوائد بنجاح. فهم شامل للالآليات الجزيئية والخلوية تشارك يتطلب تحليل الأنسجة محددة من وظائف الجينات ومسارات الإشارات. لتحقيق هذا، ويوفر النظام تيتون أداة فعالة للتعبير عن الجينات التي تسيطر عليها …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب أشكر كريستا هاس، دوريس ويبر وبريجيت كورتي للحصول على المساعدة الفنية. ويدعم العمل في المختبر Weidinger من المنح المقدمة من جمعية الألمانية للبحوث WE 4223 / 3-1، WE 4223 / 4-1 ودويتشه FÜR غزلشافت Kardiologie عن طريق أوسكار-لاب-Stipendium وكلاوس جورج اوند-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g. Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| E3 embryo medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry |
||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1 % Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g. Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, (2007).
