Die Nutzung der Teton-System, um molekulare Mechanismen bei Zebrafisch Regeneration Studieren
Summary
Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.
Abstract
The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.
Introduction
Der Zebrafisch ist ein gut etabliertes Wirbelmodellorganismus, um viele Aspekte der Entwicklung, der Physiologie, Krankheiten und Regeneration zu studieren. Mit der wachsenden Annahme der Zebrafisch als Modell für die post-embryonale biologische Prozesse, experimenteller Werkzeuge zur induzierbaren, gewebsspezifischen Manipulation der Genexpression oder Signalwege immer wichtiger geworden. Besonders haben Studien in Orgel und Anhängsel Regeneration im erwachsenen Zebrafisch aus einem Mangel an Tools für die Präparation der raum-zeitlichen Anforderungen von Signalwegen in diesen Regenerationsprozesse erlitten.
Derzeit sind drei verschiedene Systeme verwendet worden, um bedingte, gewebespezifische Genexpression in regenerierenden Organen erwachsenen Zebrafisch zu erzielen: das Cre-lox-System, Mosaik Expression von Hitzeschock induzierbares Transposon-Transgenen mit vermittelte somatischen Transgenität und die TetOn System 1 -3. TetOn bezieht sich auf eine Variante eines Tetracyclin-contgewalzten Transkriptionsaktivierungssystems, wobei die Expression in Gegenwart des Antibiotikums Tetracyclin oder einem Derivat, beispielsweise Doxycyclin aktiviert. Die Cre-lox-System, wie es bisher in ausgewachsene Fische verwendet wurde, stützt sich auf eine Tamoxifen-gesteuert Cre-Rekombinase (CreERT2), deren Expression räumlich durch gewebespezifische regulatorische Elemente beschränkt. Cre gesteuerte Entnahme einer Stop-Kassette ermöglicht die Expression des Gens von Interesse von einem Promotor, der in allen Zelltypen 1 aktiv sein soll angetrieben. Transposon-vermittelte Erzeugung von mosaik ausgedrückt somatischen Transgenen stellt ein System für die induzierbare Expression des Transgens in den einzelnen Zelllinien. Die Injektion von Zebrafischembryonen mit einem Tol2 Transposon trägt ein Gen von Interesse unter der Transkriptionskontrolle eines Hitzeschockpromotor Ergebnisse in chimären Individuen in der Regel trägt das Transgen nur in diskreten Zelllinien aus einer regenerierenden Orgel 2. Während beide Systeme ermöglichen bedingte Gewebe spesche Genexpression ist das Cre-lox-System nicht reversibel, und die Strategie mit einem Transposon-beruhenden klonalen Kennzeichnung leidet ihre stochastische Natur. So haben wir und andere kürzlich transgenen Teton Systeme für den Einsatz in Zebrafisch, der zeitlich und räumlich gesteuerte Genexpression, die zusätzlich abstimmbaren und reversible 3-5 ist zu erleichtern angepasst.
Die Teton System besteht hier aus einem transgenen Fahrer (TetActivator), in dem ein Doxycyclin (DOX) -induzierbaren Transkriptionsaktivator (verbesserte Umkehr Tetracyclin-Transaktivator, irtTA, kurze TETA) ist unter Kontrolle von gewebespezifischen genomischen regulatorischen Sequenzen. Zweitens bedarf es einer transgenen Responderlinie (TetResponder), die ein Gen von Interesse unter der Transkriptionskontrolle des Tetracyclin-Operator Häfen (Tet-Response-Element; Tetre) (Abbildung 1A). Somit ermöglicht die Verwendung von spezifischen Kombinationen von TetActivator und TetResponder Leitungen für bedingten gewebespezifischenFIC Manipulation der Genexpression.
Wir haben vor kurzem nutzte die Teton-System für gewebespezifische Funktionen des Wnt / beta-Catenin-Signalweg in der erwachsenen Zebrafisch Regenerieren Schwanzflosse 3 zu untersuchen. In dem Protokoll hier skizzierten beschreiben wir einen Workflow für Aufbau und Nutzung der Teton-System in Zebrafisch, insbesondere für Studien der fin Regeneration. Dieses enthält detaillierte Anweisungen zum stabilen transgenen TetActivator und TetResponder Linien zu erzeugen, und ein Protokoll für die Induktion Transgen in Embryonen und erwachsenen Zebrafisch. Ferner beschreiben wir Verfahren zur Überprüfung der gewebespezifischen Genexpression in der Rippe Regenerat, einschließlich eines Protokolls zur Herstellung von Gefrierschnitten von adulten Zebrafischflossen. Zusätzlich diskutieren wir Überlegungen für den Entwurf des TetActivator Transgen, die Wahl eines Transgeneseverfahren und Nachweis von TetResponder Ausdruck. Daher ist das übergeordnete Ziel dieses Protokolls als Blaupause dienenfür den Aufbau einer funktionellen Teton Systems im Zebrafisch zu bedingten gewebespezifische Genexpression, die zu jedem Gewebe von Interesse angewendet werden kann, zu erreichen.
Wir haben eine TetActivator der Vektor ermöglicht für I-SceI oder Tol2 vermittelte Erzeugung stabiler TetActivator Linien mit kurzen genomischen regulatorischen Sequenzen erzeugt (Enhancer Fragmente; Weidinger lab Plasmid Datenbank nicht 1247;. 1B). Dieses Konstrukt enthält eine TetActivator Kassette, bestehend aus dem M2 mutierten Variante der reversen Tet-Repressor-Domäne mit dem Herpes simplex-Virus VP16-Transaktivierungsdomäne-Derivat 3F [irtTAM2 (3F)] fusioniert. Expression des TetActivator (TETA) kann leicht überwacht werden, da es coexprimiert mit dem Fluorophor AmCyan aus demselben offenen Leserahmen; a p2a Peptid vermittelt ribosomalen Skipping, die bei der Herstellung von TETA und AmCyan als separate Proteine bei einer 1 führen sollte: 1-Verhältnis 5,6. Das Konstrukt enthält auch eine poylinker 5 'der TetActivator Kassette, um die Einführung der genomischen regulatorischen Sequenzen von Interesse unter Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren zu erleichtern.
, Der in ein bakterielles künstliches Chromosom rekombiniert werden können (BAC), die eine große genomische Region (; Zusätzlich haben wir ein Konstrukt, bestehend aus dem oben beschriebenen Kassetten TetActivator plus Kanamycin-Selektionskassette (. 1C Weidinger lab Plasmid Datenbank nicht 1180) erstellt in der Regel in dem Startcodon eines Gens, dessen Expressionsmuster ist durch das Transgen nachgeahmt werden). Beide Konstrukte sind von der Weidinger Labor auf Anfrage erhältlich.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die erwachsenen Zebrafisch hat eine erstaunliche Fähigkeit, viele der inneren Organe und Anhänge erfolgreich zu regenerieren. Ein gründliches Verständnis der molekularen und zellulären Mechanismen erfordert gewebespezifische Analyse von Gen-Funktionen und Signalwege. Auf dem Weg zu diesem bietet die Teton-System ein effizientes Werkzeug für die raumzeitlich gesteuerte Genexpression in embryonalen und erwachsenen Zebrafisch. Die Teton System Konstrukte und Methoden in dieser Handschrift beschrieben wurden erfolgrei…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken Christa Haase, Doris Weber und Brigitte Korte für die technische Unterstützung. Arbeit im Labor Weidinger durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1 unterstützt, WE 4223 / 4-1 und von der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie über eine Oskar-Lapp-Stipendium und ein Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g. Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| E3 embryo medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry |
||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1 % Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g. Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
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