Bruk av Teton system for å studere molekylære mekanismer av Sebrafisk Regeneration

Summary

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Abstract

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Introduction

Sebrafisk er et veletablert virveldyr modellorganisme for å studere mange aspekter av utvikling, fysiologi, sykdom og regenerering. Med den økende bruk av sebrafisk som en modell for post-embryonale biologiske prosesser, eksperimentelle verktøy for induserbar, vev-spesifikk manipulering av genekspresjon eller signalveier er blitt stadig viktigere. Spesielt har undersøkelser i organ og vedheng regenerering hos voksne sebrafisk lidd av mangel på verktøy for disseksjon av rom-tid-kravene til signalveier i disse regenerative prosesser.

Foreløpig har tre forskjellige systemer blitt brukt til å oppnå betinget, vev-spesifikk genekspresjon i regenererende organer av voksen sebrafisk: Cre-lox system, mosaikk uttrykk for varmesjokk induserbare transgener ved hjelp transposonet-mediert somatisk transgenesis, og Teton system ^{1 -3.} Teton refererer til en variant av en tetracyklin-contvalset transkripsjonen aktiveringssystem, hvor ekspresjon blir aktivert i nærvær av antibiotikumet tetracyklin, eller et derivat, f.eks doksycyklin. CRE lox-system, slik det hittil har vært brukt i voksen fisk, er avhengig av en Tamoxifen styrt Cre rekombinase (CreERT2), hvis ekspresjon er romlig begrenset av vevsspesifikke regulatoriske elementer. Cre-drevet fjerning av et STOP kassett letter ekspresjon av genet av interesse drevet av en promoter som skal være aktive i alle celletyper ^en. Transposon-mediert etableringen av mosaically uttrykt somatiske transgener gir et system for induserbar transgene uttrykk i enkelte celle linjene. Injeksjon av sebrafisk embryoer med et Tol2 transposon bærer et gen av interesse under transkripsjonen kontroll av en varmesjokkpromotor resulterer i kimære individer vanligvis bærer transgenet bare i adskilte celle linjer av et regenererende organ ^2. Mens begge systemene tillater betinget tissue-specific genuttrykk, er Cre-lox systemet ikke reversible, og strategien bruker transposonet baserte klonal merking lider av sin stokastiske natur. Dermed har vi og andre nylig tilpasset transgene Teton systemer til bruk i sebrafisk, som letter timelig og romlig-kontrollerte genuttrykk som er i tillegg fleksibel og reversibel ^3-5.

The Jackson system som brukes her omfatter en transgen linje driver (TetActivator) hvor en Doksycyklin (DOX) -inducible transkripsjonen aktivator (forbedret omvendt tetracyklin transaktivator, irtTA, kort TETA) er under kontroll av vevsspesifikke regulatoriske genomiske sekvenser. For det andre krever den en transgen linje responder (TetResponder) som havner et gen av interesse under transkripsjonen kontroll av Tetracycline operatør (Tet responselement, Tetre) (figur 1A). Dermed tillater bruk av bestemte kombinasjoner av TetActivator og TetResponder linjer for betinget tissue-spesiFIC manipulering av genuttrykk.

Vi har nylig brukt Teton system å sondere for vevsspesifikke funksjoner av Wnt / beta-catenin signale i voksen regenererende sebrafisk halefinnen ^tre. I protokollen skissert her beskriver vi en arbeidsflyt for oppsett og bruk av Teton system i sebrafisk, spesielt for studier av fin regenerering. Dette inkluderer detaljerte instruksjoner om hvordan å generere stabile transgene TetActivator og TetResponder linjer og en protokoll for transgen induksjon i embryoer og voksen sebrafisk. Videre beskrives metoder for verifikasjon av vev-spesifikk genekspresjon i finnen regenerere, inkludert en protokoll for fremstilling av frysesnitt av voksne sebrafisk finnene. I tillegg diskuterer vi hensyn til utformingen av TetActivator transgenet, valg av en transgenesis metode, og påvisning av TetResponder uttrykk. Derfor er den overordnede målet med denne protokollen er å tjene som en blåkopifor å sette opp et funksjonelt Jackson system i sebrafisk for å oppnå betinget vev-spesifikk genekspresjon, som kan brukes på alle vev av interesse.

Vi har laget en TetActivator vektor slik at for I-SCEI eller Tol2-mediert generasjon av stabile TetActivator linjer ved hjelp av korte genomiske regulatoriske sekvenser (enhancer fragmenter; Weidinger lab plasmid database no 1247;. Figur 1B). Denne konstruksjon inneholder et TetActivator kassett bestående av M2 muterte variant av den reverserte Tet repressor domene fusert med Herpes simplex virus VP16 trans domene-derivatet 3F [irtTAM2 (3F)]. Ekspresjon av TetActivator (TETA) kan lett overvåkes siden det er ko-uttrykt med fluoroforen AmCyan fra den samme åpne leseramme; en P2A peptid medierer ribosomalt hopper, som skulle resultere i produksjon av TETA og AmCyan som separate proteiner ved et 1: 1-forhold ^5,6. Konstruksjonen inneholder også en poylinker 5 'av TetActivator kassett for lettere å plassere genomiske regulatoriske sekvenser av interesse med konvensjonelle kloning metoder.

I tillegg har vi laget en konstruksjon som består av de ovenfor beskrevne TetActivator kassetten samt et Kanamycin utvalg kassetten (Weidinger lab plasmid database no 1180;. Figur 1C), som kan bli rekombinert inn i et bakterielt kunstig kromosom (BAC) som inneholder en stor genomisk region ( vanligvis inn i startkodonet til et gen hvis ekspresjon mønster som skal etterlignes ved transgenet). Begge konstruksjoner er tilgjengelige fra Weidinger lab på forespørsel.

Protocol

1. generasjon av transgene TetActivator Fisk Lines Generering av TetActivator konstruere Clone regulatoriske sekvenser av interesse oppstrøms for TetActivator kassett i vektor # 1247 ved bruk av standard teknikker. Alternativt kan bruke rekombinasjonsteknikker for å generere en BAC, hvor TetActivator kassetten (vektor # 1180) settes inn i det første exon av målgenet, og hvor Tol2 inverterte gjentagelser føres inn i BAC ryggraden (for en detaljert recombineering protokollen ser 7,8). <…

Representative Results

For å etablere et funksjonelt Teton system for vevsspesifikt induserbar genuttrykk, transgen TetActivator og TetResponder linjer må genereres (figur 1A). Dette oppnås ved microinjecting TetActivator (figur 1 B – C) eller TetResponder (figur 1E) konstruerer i tidlige embryoer sebrafisk og påfølgende bakterie-line integrasjon. Funksjonelle TetActivator konstruksjoner kan enten frembringes ved kloning av korte regulatoriske sekvenser (enhancerelemente…

Discussion

Den voksne sebrafisk har en utrolig evne til å lykkes regenerere mange indre organer og lemmer. En grundig forståelse av molekylære og cellulære mekanismene som er involvert krever vevsspesifikt analyse av genfunksjoner og signalveier. Mot dette, gir Teton systemet et effektivt verktøy for spatiotemporally kontrollert genuttrykk i embryonale og voksen sebrafisk. Teton system konstruerer og metodikk som er beskrevet i dette manuskriptet har blitt brukt i en fersk studie av vårt laboratorium ^tre. Følgend…

Materials

Breeding boxes	Aqua Schwarz	AquaBox 1
Compound fluorescent microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	to image fluorescent tissue sections
Confocal microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	to image fluorescent tissue sections
Cryostat	e.g. Leica, Thermo-Scientific	varies with the manufacturer	for cryosectioning
4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi)	Sigma-Aldrich	D9542	use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891	prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction
E3 embryo medium			5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich	P6148	4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation
1x Phosphat-buffer saline (PBS)			1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5
1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)			1x PBS with 0.1 % Tween 20
Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides	Thermo Scientific	1014356190	for collection of tissue sections
Stereo fluorescent microscope	e.g. Leica, Zeiss	varies with the manufacturer	for fluorescence-based genotyping
Thermocycler	e.g. Biorad, Applied Biosystems	varies with the manufacturer	for PCR-based genotyping
Tissue freezing medium (TFM)	Triangel Biomedical Sciences	TFM-C	for embedding of tissue samples
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)	Sigma-Aldrich	E10521	for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium