Teton Sisteminin Kullanımı Moleküler Mekanizmalar Zebra balığı Yenilenme Eğitim için
Summary
Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.
Abstract
The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta–catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.
Introduction
Zebra balığı geliştirme, fizyoloji, hastalık ve yenilenme birçok yönlerini incelemek için iyi kurulmuş bir omurgalı model organizmadır. Gen ekspresyonu ya da sinyalleme yollarının indüklenebilir, dokuya özgü manipülasyon için post-embriyonik biyolojik süreçler, deney aletleri için bir model olarak zebrabalıkları artan kabulü ile giderek daha önemli hale gelmektedir. Özellikle yetişkin Zebra balığı organ ve apendiks rejenerasyon içine çalışmalar bu rejeneratif sürecinde sinyal yolları uzay-zamansal gereksinimleri diseksiyon için bir araç eksikliğinden muzdarip.
Şu anda, üç farklı sistem koşullu, dokuya özgü, yetişkin zebrabalıkları organlarını rejenere içinde gen ekspresyonunu elde etmek için kullanılmıştır: Cre-lox sistemi, transpozon-aracılı somatik transgenesis kullanılarak ısı-şoku uyarılabilir transgenlerin mozaik ifadesi ve teton sistemi 1 -3. Teton bir tetrasiklin-CONT bir türevi anlamına gelirsentezleme antibiyotik tetrasiklin veya bunun bir türevini, örneğin doksisiklin mevcudiyetinde aktive haddelenmiş transkripsiyonel aktivasyon sistemi. Şimdiye kadar yetişkin balıklarda kullanıldıktan Cre-lox sistemi, ekspresyonu uzamsal dokuya özel düzenleyici elementler tarafından kısıtlanan bir Tamoksifen kontrollü Cre rekombinazın (CreERT2) dayanır. DUR kasetinin Cre güdümlü çıkarılması tüm hücre tipleri 1 aktif olması gereken bir promoter tarafından tahrik edilen ilgili gen ekspresyonunu kolaylaştırır. Mosaically ifade somatik transgenlerin transpozon aracılı oluşturma tek tek hücre soyları indüklenebilir transgen ifadesi için bir sistem sağlamaktadır. Tipik olarak sadece bir yenileyici organın 2 ayrı hücre soyları içinde transgeni taşıyan kimerik bireyde bir ısı şoku promotör sonuçları transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni taşıyan bir Tol2 transpozonu sahip zebra balığı embriyoların enjeksiyonu. Her iki sistem şartlı doku SPE için izin ikenreli gen ifadesi, Cre-lox sistemi geri dönüşümlü değildir ve transpozon tabanlı klonal etiketleme kullanarak stratejisi stokastik doğası muzdarip. Böylece, ve diğerleri en son zamansal ve ilave ayarlanabilir ve geri 3-5 olan uzamsal olarak kontrollü gen ekspresyonu kolaylaştırmak zebrabalıkları kullanım için transgenik teton sistemleri, adapte edilmiştir.
Burada kullanılan teton sistemi Doksisiklin (DOX) -inducible transkripsiyonel aktivatör (ters tetrasiklin transaktivatör, irtTA kısa Tet geliştirilmiş) dokuya-özgü genom düzenleyici dizilerin kontrolü altında olduğu bir transgenik sürücü hattı (TetActivator) içerir. (; TetRE Tet yanıt elemanı) (Şekil 1A) İkinci olarak, bir transgenik cevap hattı tetrasiklin operatör transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni barındıran (TetResponder) gerektirir. Bu nedenle, TetActivator ve TetResponder hatları özel kombinasyonlarının kullanımı koşullu doku speci sağlargen ifadesinin fic manipülasyon.
Biz son zamanlarda Zebra balığı kuyruk yüzgeci 3 yenileyici yetişkin Wnt / beta-katenin sinyalizasyon doku-spesifik fonksiyonlar için prob teton sistemini kullanmışlardır. Burada özetlenen protokolde yüzgeç yenilenme çalışmaları için özellikle zebrafish Teton sisteminin set-up ve kullanım için bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu detaylı istikrarlı transgenik TetActivator ve TetResponder hatlarını oluşturmak için nasıl talimatlar ve embriyo ve yetişkin zebrabalıkları transgen indüksiyon için bir protokol içerir. Ayrıca, yetişkin zebrabalıkları kanatların cryosections hazırlanması için bir protokol içeren kanatçık yenilenme bölgesindeki dokuya özel gen ekspresyonunun doğrulanması için teknikler tarif eder. Ayrıca, TetResponder ifade TetActivator transgen tasarımı, bir transgenesis yönteminin seçimi ve tespiti için tartışılacaktır. Bu nedenle, bu protokolün genel amacı, bir plan olarak hizmet etmektirkurulma fonksiyonel teton sistemi zebrabalıkları daki herhangi bir dokuya uygulanabilir koşullu dokuya-özgü gen ekspresyonunu elde etmek için.
Biz I-SceI veya kısa genomik düzenleyici diziler kullanılarak stabil TetActivator hatlarının Tol2 aracılı üretimi için izin veren bir TetActivator vektör oluşturduk (güçlendirici fragmanları; Weidinger laboratuar plazmid veritabanı henüz 1247;. Şekil 1B). Bu yapı, Herpes simpleks virüsü VP16 transaktivasyon alanı türev 3F [irtTAM2 (3F)] ile kaynaşmış ters Tet bastırıcı etki M2 mutant varyantı aşağıdakilerden oluşan bir TetActivator kaseti içerir. Bu ko-eksprese aynı açık okuma çerçevesi arasında fluorofor AmCyan sahip olduğu TetActivator (TETA) sentezlenmesi, kolayca izlenebilir; 1 oranında 5,6: a P2A peptit 1 ayrı proteinler olarak teta ve AmCyan üretimi ile sonuçlanmalıdır ribozomal atlama, aracılık eder. Bu yapı, T ', bir poylinker 5 içeriretActivator kaseti, klasik klonlama yöntemleri kullanılarak ilgili genomik düzenleyici diziler sokulmasını kolaylaştırmak için.
(Büyük bir genomik bölgeyi ihtiva eden bir bakteriyel yapay kromozom içine yeniden birleştirilebilir, (BAC), Buna ek olarak, yukarıda tarif edilen TetActivator kaset ve bir kanamisin seçme kaseti (Şekil 1C. Weidinger laboratuar plazmid veri tabanında bir 1180) 'den oluşan bir yapı oluşturduk Genellikle ekspresyon paterni olan transgen tarafından taklit edilecek) bir genin başlangıç kodonunun halinde. Her iki yapılar istek üzerine Weidinger laboratuarında temin edebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
yetişkin zebrabalıkları başarıyla birçok iç organları ve ekleri yenilemek için inanılmaz bir kapasiteye sahiptir. Katılan moleküler ve hücresel mekanizmaların bir anlayışa gen fonksiyonları ve sinyal yollarının doku spesifik analiz gerektirir. Bu doğru, Teton sistemi embriyonik ve yetişkin zebrafish spatiotemporally kontrollü gen ifadesi için etkin bir araç sağlar. Bu yazıda anlatılan Teton sistem yapıları ve metodoloji başarıyla laboratuvar 3 son bir çalışmada kullanılmış…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar teknik yardım için Christa Haase, Doris Weber ve Brigitte Korte teşekkür ederiz. Weidinger laboratuarında çalışmak Deutsche Forschungsgemeinschaft BİZ 4223 / 3-1 hibe tarafından desteklenen, 4223 / 4-1 ve Deutsche Gesellschaft für Kardiologie bir Oskar-Lapp-Stipendium aracılığıyla ve Klaus-Georg-und-Sigrid- tarafından BİZ Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g. Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| E3 embryo medium | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2· 2 H2O, 0.33 mM MgSO4·7 H2O, 0.2 ‰ (w/v) methylene blue, pH 6.5 for embryo/larvae husbandry |
||
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4 % (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1 % Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g. Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g. Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, (2007).
