עכבר דגם של דחיית כלי דם הנוצרת על-Alloimmune וטרשת עורקים להשתלות
Summary
We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.
Abstract
Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.
Introduction
מעל 30 + השנים האחרונות, התקדמות בתרופות לדיכוי המערכת החיסונית הצטמצמה דחיית שתל בשל דחייה חריפה אבל דחייה כרונית עדיין מהווה אתגר עיקרי. הביטוי העיקרי של דחיית השתלת לב הכרונית הוא טרשת עורקים השתלה (ת"א) 1,2. מצב זה מאופיין על ידי היפרפלזיה intimal וחוסר תפקוד של עורקי vasomotor שתל ומתפתח כתוצאה של מיקוד חיסוני של תאי שריר אנדותל וחלק על ידי המערכת החיסונית הנמען. המיקוד הספציפי של כלי דם השתל בשל הכרה מורכבת הזר פפטיד-גדול histocompatibility (MHC) מודגש על ידי הפיתוח של ת"א באופן בלעדי בעורקי שתל תוך חוסך כלי מארח 3. בקנה אחד עם זה הוא התצפית שת"א אינה מתרחשת באופן ניסיוני כאשר הנמען הוא זהה מבחינה גנטית לתורם או כאשר הנמען חסר תאי T ו- B 4. פציעה של כלי דם בתיווך חיסוני וdysfunction גורם להתפתחות של עיבוי intimal וסיסטיק, כמו גם ההצטברות החריגה של שומנים וחלבוני ECM, בת"א 5. עיבוי intimal נוטה להיות קונצנטריים לאורך 4-6 עץ עורקים כולו. אובדן שתל ומוות מתרחשים בדרך כלל כתוצאה מאיסכמיה מתקדמת כתוצאה מחסימה של עורקי luminal שתל 4.
בשינה 1991, Mennander et al. 7 חלוצים מודל חציצת אב העורקים בחולדות מודל ת"א. מספר קבוצות שלאחר מכן מותאמות הליך זה לשימוש בעכברים. במודל זה, מגזרי אב העורקים שתל לפתח נגעים שיש להם תכונות דומות לת"א נצפו בהשתלות קליניות. זה כולל עיבוי intimal המאופיין בהצטברות של תאים כמו שריר חלק ולויקוציטים נמען 7. מעל 2 העשורים האחרונים מודל זה נעשה שימוש כדי ליצור תובנה חשובה למנגנונים של פגיעה בכלי הדם, דחייה ות"א. זה יכול להיות לנואד לבחון שאלות הקשורות למערכת חיסונית וכלי דם במהלך פתולוגיה עורקים. הבחירה של השפעות חוסר התאמת אנטיגן היכולת לטפל כראוי על שאלות אלה.
השתלה פני מחסומי MHC מלאים מאפשרת הערכה מקיפה של תגובות חיסוניות שידועים כי הם יהיו מעורבים בדחיית השתלות איברים. זה כולל הכרה ישירה CD4 ו CD8 T תא ומיקוד של פפטיד הזר-MHC שהוצג על ידי תאים שמקורם שתל, CD4 העקיף (ואולי CD8) הכרת T תא ומיקוד של alloantigens נגזר שתל שהוצג על ידי אנטיגן נמען מציג תאים, וantibody- הכרה בתיווך של alloantigens על משטחי תא כלי דם 8. עם זאת, התגובה של כלי הדם לפגיעה בניסויים הלא תואמים-MHC מלאים עשויה להיות שונה מזה שנצפה קליני. ג'ונסון et al. 9 הראה כי, בשתלי אב העורקים חציצה מושתלים על פני מחסום חוסר התאמת MHC מלא, רובתאי neointimal הם ממוצא נמען ולא ממוצא תורם. זה שונה מזה שנצפה בהשתלות אנושיות שבו רוב תאי שריר חלק intimal הם ממוצא תורם 9,10. כדי להסביר למגבלה זו, מודלים ניסיוניים חלופיים שכרוכים בהשתלה על פני חוסר ההתאמה אנטיגן histocompatibility קטין פותחו כי לעורר תגובות של כלי דם שדומים יותר לאלו שנצפו בהשתלת קלינית 11. בעוד מודלים החלופיים אלה מאפשרים למסקנות חשובים להתבצע לגבי התגובות של כלי דם המניע את ההתפתחות של ת"א, התהליכים החיסוניים הגורמים לדחייה של כלי דם בשתלים תואמים אנטיגן histocompatibility קטין לא לגמרי מחדש להיכנע אלה המתרחשים בסביבה הקלינית. לדוגמא, אנטיגנים histocompatibility קטין מוכרים היטב על ידי נוגדנים תגובתי שתל 12. בהתחשב בשיקולים שפורט לעיל, חשוב לשקול את Questi פתולוגיעל נבחן בעת בחירת הסוג של חוסר התאמת אנטיגן בשימוש במודל חציצת אב העורקים. כאן אנו מתארים פרוטוקול מפורט להשתלת חציצת אב העורקים בעכברים. אנו מתארים השתלת חציצה בין עכברי MHC-תואמים מלאים אבל באותו הפרוטוקול משמש להשתלה על פני זני עכבר אחרים אנטיגן תואמים.
Protocol
Representative Results
Discussion
יש לנו תיארנו פרוטוקול לחציצת אב העורקים השתלה בעכברים שהם שימושי ללימוד דחייה של כלי דם בתיווך חיסוני ות"א. מודל זה יכול לשמש כדי לחקור את הסיבות לת"א, כמו גם את הפיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות. זה כבר נעשה שימוש בעבר להקים תפקיד חיוני של חסינות אדפטיבית, תג…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמוסד הקנדי לבריאות מחקר ולב ושבץ קרן של BC ויוקון (JCC).
Materials
| Name | Company | Catalogue | Comments |
| C57BL/6J (H-2b) | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 000664 | |
| Balb/cBYJ | Jackson Laboratories, Bar Harbour ME | Strain# 001026 | |
| Ketamine Hydrochloride Injection USP 100 mg/ mL | Ketalean | DIN 00612316 | |
| Xylazine Injection 20 mg/mL | Rompum | DIN 02169592 | |
| Ketoprofen Injection 100 mg/mL | Anafen | DIN 01938126 | |
| Butorphanol Tartrate injection 10 mg/mL | Torbugesic | DIN 008450000 | |
| Buprenorphine Injection 0.3 mg/mL | Reckitt Benckiser | B.N. 5241 | |
| Atipamezole hydrochloride sterile injectable solution | Antisedan | DIN 02237744 | |
| Heparin Sodium Injection, USP, 1000 units/mL | McKesson Distribution | DIN 02264315 | |
| Tears naturale ophthalmic ointment | Alcon | DIN 02082519 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| 0.9% Sodium Chloride, sterile | Baxter Corporation | ||
| Lactated Ringer’s solution, sterile | Baxter Corporation | ||
| 0.9% Sodium Chloride Injection, sterile, 10 mL | Baxter Corporation | ||
| Alcohol Prep Pads | Loris | ||
| Povidone Iodine | Betadine | ||
| Chlorohexidine Gluconate 4% w/v | Germi-Stat | ||
| Black Polyamide Monofilament | AROSurgical Instruments | T4A10Q07 | |
| Suture, 10-0 suture, 70 microns | Corporation | ||
| Blue monofilament suture 5-0, P3 needle | Ethicon | 8698G | |
| 1 ml Syringe | BD | REF 309659 | |
| 10 ml Syringe | BD | REF 309604 | |
| 1cc TB insulin syringe with 28G 1/2 | BD | REF 309309 | |
| 25G 7/8, hypodermic needle | BD | REF 305124 | |
| 27G 1/2, hypodermic needle | BD | REF 305109 | |
| Colibri Retractor- 1.5cm spread 4cm | Fine Science Tools | 17000-04 | |
| S&T CAF-4 Clip applying forceps, without lock | Fine Science Tools | 00072-14 | |
| Supergrip forceps, S&T | Fine Science Tools | 00632-11 | |
| Medical No.5 forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | |
| Lexer Baby Scissors | Fine Science Tools | 14078-10 | |
| Micro Adson forceps serrated | Fine Science Tools | 11018-12 | |
| Vannas-Tubingen microscissors | Fine Science Tools | 15003-08 | |
| Micro clamps, b-1; 3.5mm x 1mm; 7mm length | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Graefe-forceps, 10cm 1×2 teeth | Fine Science Tools | 11054-10 | |
| Castroviejo with lock and tungsten jaws | Fine Science Tools | 12565-14 | |
| Hot glass bead sterilizer | Inotech 250 | IS-250 – Steri-250 | |
| Non-woven gauzes | Progene | ||
| Cotton Tipped Applicators | Puritan | ||
| Beard Trimmer | Wahl | ||
| Heating pad | Sunbeam |
References
- Billingham, M. E. Graft coronary disease: the lesions and the patients. Transplant Proc. 21, 3665-3666 (1989).
- Foegh, M. L. Chronic rejection–graft arteriosclerosis. Transplant Proc. 22, 119-122 (1990).
- Libby, P., Pober, J. S. Chronic rejection. Immunity. 14, 387-397 (2001).
- Tellides, G., Pober, J. S. Interferon-gamma axis in graft arteriosclerosis. Circulation research. 100, 622-632 (2007).
- Johnson, D. E., Gao, S. Z., Schroeder, J. S., DeCampli, W. M., Billingham, M. E. The spectrum of coronary artery pathologic findings in human cardiac allografts. The Journal of heart transplantation. 8, 349-359 (1989).
- Gao, S. Z., Alderman, E. L., Schroeder, J. S., Silverman, J. F., Hunt, S. A. Accelerated coronary vascular disease in the heart transplant patient: coronary arteriographic findings. Journal of the American College of Cardiology. 12, 334-340 (1988).
- Mennander, A., et al. Chronic rejection in rat aortic allografts. An experimental model for transplant arteriosclerosis. Arterioscler Thromb. 11, 671-680 (1991).
- Choy, J. C. Granzymes and perforin in solid organ transplant rejection. Cell Death Differ. 17, 567-576 (2010).
- Johnson, P., Carpenter, M., Hirsch, G., Lee, T. Recipient cells form the intimal proliferative lesion in the rat aortic model of allograft arteriosclerosis. Am J Transplant. 2, 207-214 (2002).
- Minami, E., Laflamme, M. A., Saffitz, J. E., Murry, C. E. Extracardiac progenitor cells repopulate most major cell types in the transplanted human heart. Circulation. 112, 2951-2958 (2005).
- Yu, L., et al. AIP1 prevents graft arteriosclerosis by inhibiting interferon-gamma-dependent smooth muscle cell proliferation and intimal expansion. Circ Res. 109, 418-427 (2011).
- Miller, C., DeWitt, C. W. Cellular and humoral responses to major and minor histocompatibility antigens. Transplant Proc. 5, 303-305 (1973).
- Tsutsui, H., et al. Lumen loss in transplant coronary artery disease is a biphasic process involving early intimal thickening and late constrictive remodeling: results from a 5-year serial intravascular ultrasound study. Circulation. 104, 653-657 (2001).
- Rossum, A., Enns, W., Shi, P., MacEwan, G. E., Choy, J. C. Bim regulates allogeneic immune responses and transplant arteriosclerosis through effects on T cell activation and death. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34, 1290-1297 (2014).
- Ho, M. K., Springer, T. A. Tissue distribution, structural characterization, and biosynthesis of Mac-3, a macrophage surface glycoprotein exhibiting molecular weight heterogeneity. J Biol Chem. 258, 636-642 (1983).
- Inoue, T., Plieth, D., Venkov, C. D., Xu, C., Neilson, E. G. Antibodies against macrophages that overlap in specificity with fibroblasts. Kidney international. 67, 2488-2493 (2005).
- Shi, C., et al. Immunologic basis of transplant-associated arteriosclerosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 4051-4056 (1996).
- Skaro, A. I., et al. CD8+ T cells mediate aortic allograft vasculopathy by direct killing and an interferon-gamma-dependent indirect pathway. Cardiovasc Res. 65, 283-291 (2005).
- Tellides, G., et al. Interferon-gamma elicits arteriosclerosis in the absence of leukocytes. Nature. 403, 207-211 (2000).
- Wang, Y., et al. Interferon-gamma induces human vascular smooth muscle cell proliferation and intimal expansion by phosphatidylinositol 3-kinase dependent mammalian target of rapamycin raptor complex 1 activation. Circ Res. 101, 560-569 (2007).
- Soulez, M., et al. The perlecan fragment LG3 is a novel regulator of obliterative remodeling associated with allograft vascular rejection. Circ Res. 110, 94-104 (2012).
- Choy, J. C., Kerjner, A., Wong, B. W., McManus, B. M., Granville, D. J. Perforin mediates endothelial cell death and resultant transplant vascular disease in cardiac allografts. Am J Pathol. 165, 127-133 (2004).
- Choy, J. C., et al. Granzyme B induces endothelial cell apoptosis and contributes to the development of transplant vascular disease. Am J Transplant. 5, 494-499 (2005).
- Reis, E. D., et al. Dramatic remodeling of advanced atherosclerotic plaques of the apolipoprotein E-deficient mouse in a novel transplantation model. Journal of vascular surgery. 34, 541-547 (2001).
- Potteaux, S., et al. Suppressed monocyte recruitment drives macrophage removal from atherosclerotic plaques of Apoe-/- mice during disease regression. J Clin Invest. 121, 2025-2036 (2011).
