Entrega Protein direto para células de mamíferos utilizando células-permeável Cys<sub> 2</sub> -His<sub> 2</sub> Domínios zinc-finger
Summary
Domínios dedo-de-zinco são intrinsecamente célula-permeável e capaz de mediar a entrega de proteína em uma ampla gama de tipos de células de mamíferos. Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo para a implementação da tecnologia de dedo de zinco para a entrega intracelular de proteínas é apresentada.
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
Altamente estratégias de fornecimento de proteína eficientes e versáteis são críticos para muitos pesquisa básica e aplicações terapêuticas. A entrega directa das proteínas purificadas em células representa um dos métodos mais seguros e mais fáceis para alcançar este objectivo. 1,2 Ao contrário das estratégias que dependem de expressão de genes de ácidos nucleicos, 3-5 entrega proteína não apresenta nenhum risco de mutagénese de inserção, é independente do transcrição / máquinas e tradução celular permite um efeito imediato. No entanto, a falta de métodos simples e generalizáveis para dotar a atividade de penetração celular para proteínas confunde rotineiramente sua entrada direta nas células. Os métodos actuais para facilitar a entrega intracelular de proteínas são baseadas no uso de ocorrência natural ou 6-8 concebidos de penetração de células, péptidos 9-12 domínios de transdução de sobrealimentação, 13,14 nanopartículas 15, 16 e lipossomas partículas semelhantes a vírus 17,18 </sup> e materiais de microesferas poliméricas. 19 Infelizmente, muitas dessas abordagens são dificultados pelas taxas de captação celular baixos, 20,21 pobre estabilidade, 22 inadvertida tipo de célula de especificidade, 23 propriedades de escape baixo endossomais 24 e toxicidade. 25 Além disso, muitos proteína tecnologias de transdução de reduzir a bioactividade das proteínas entregues 14.
O nosso laboratório demonstrou anteriormente que zinc-finger nuclease proteínas (ZFN) – endonucleases de restrição quimérico que consiste de uma Cys His 2 2 zinc-finger programável proteína de ligação a ADN e domínio de clivagem da endonuclease de restrição FokI 26-28 – são inerentemente célula.dia permeável. 29 Esta actividade de penetração celular surpreendente mostrou ser uma propriedade intrínseca do domínio dedo-de-zinco personalizados, com uma plataforma de ligação de ADN que surgiu como uma ferramenta poderosa para o genoma segmentado enengenha-, 30-32 e ser considerada como o resultado da constelação de seis resíduos carregados positivamente na superfície da proteína. De facto, várias proteínas de ligação de ADN, incluindo c-Jun e N-DEK foram mostrados para possuir uma capacidade inata para atravessar as membranas celulares. 33 Mais recentemente, no nosso laboratório expandido estes resultados e demonstraram que a actividade da célula de penetração de zinco finger (ZIF) da domínios poderia ser aproveitado para a entrega de proteínas intracelulares. Fusão genética de ambos domínios ZIF de um ou dois dedos para carga proteína específica levou a absorção eficiências que superaram muitos sistemas de entrega de peptídeos convencionais de penetração celular. 34 Mais notavelmente, entrega ZiF mediada não comprometeu a atividade de carga enzimática fundido e facilitado altos níveis de entrega cytosolic. Colectivamente, estes resultados demonstram o potencial do domínio ZiF para facilitar a entrega eficiente e fácil de proteínas, e potencialmente mais diversos tipos de macromoléculas, em células.
Aqui, um protocolo detalhado passo-a-passo sobre como implementar a tecnologia ZiF para entrega de proteína em células de mamíferos é apresentada. Nós previamente construído um conjunto de um, dois, três, quatro, cinco e seis domínios dedo-Zif que não possuem a capacidade de se ligar ao ADN, devido a substituição de cada um dos resíduos de ligação ao ADN de hélice α, mas são capazes de fornecer proteínas em células 34 (Figura 1). A produção e a transdução de esmeralda GFP (EmGFP) em células HeLa usando um domínio ZiF de dois dedos é descrito. Este protocolo é extensível para quase qualquer proteína solúvel capaz de expressão em Escherichia coli e quase qualquer tipo de células de mamíferos. Os resultados esperados são fornecidos e estratégias para maximizar o desempenho do sistema também são discutidos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, um protocolo passo-a-passo para a entrega de proteína utilizando dedo de zinco (ZiF) domínios de células-permeável é apresentado. O domínio ZiF não reduz a atividade de carga enzimática fundido 34; permite a produção e purificação de proteínas em rendimentos quase idênticos aos observados com a proteína não modificada; e pode transportar proteínas e enzimas para uma ampla gama de tipos de células, com as eficiências que excedem os sistemas tradicionais de penetração de células de p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (DP1CA174426 para Carlos F. Barbas) e da Universidade ShanghaiTech, Shanghai, China (a JL). Gráficos moleculares foram gerados utilizando pymol.
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
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