Direkte Protein Levering til pattedyrceller Bruke Cell-gjennomtrengelig Cys<sub> 2</sub> -Hans<sub> 2</sub> Sink-finger domener
Summary
Sink finger-domener er iboende celle-gjennomtrengelige og i stand til å mediere proteinlevering til et bredt utvalg av pattedyrcelletyper. Her er en detaljert steg-for-steg-protokollen for å implementere sink-finger-teknologien for intracellulær protein levering presentert.
Abstract
Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.
Introduction
Svært effektive og allsidige protein levering strategier er kritisk for mange grunnleggende forskning og terapeutiske anvendelser. Den direkte levering av rensede proteiner i celler representerer en av de sikreste og enkleste metoder for å oppnå dette. 1,2 motsetning strategier som er avhengige av genekspresjon fra nukleinsyrer, proteiner utgjør 3-5 levering ingen risiko for insertional mutagenese, er uavhengig av cellulær transkripsjon / oversettelse maskiner og åpner for en umiddelbar effekt. Men forundrer mangelen på enkle og generaliseres metoder for endowing celle-trengende aktivitet på proteiner rutinemessig sine direkte inntreden i cellene. Nåværende metoder for å lette intracellulær proteinlevering er basert på bruk av naturlig forekommende 6-8 eller utformet cellepenetrerende peptider, 9-12 kompressor transduksjon domener, 13,14 nanopartikler 15 og liposomer, 16-viruslignende partikler 17,18 </sup> og polymere mikro materialer. 19 Dessverre er mange av disse tilnærmingene er hemmet av lave cellulært opptak priser, 20,21 dårlig stabilitet, 22 utilsiktet celle-type spesifisitet, 23 lav endosomal rømningsegenskaper 24 og toksisitet. 25 I tillegg er mange protein transduksjon teknologier redusere bioaktiviteten av de leverte proteiner. 14
Vårt laboratorium tidligere vist at sink-finger-nuklease (ZFN) proteiner – kimære restriksjonsendonukleaser som består av en programmerbar Cys 세스 -Hans 2 sink-finger-DNA-bindende protein, og spalting domenet til FoKI restriksjonsendonuklease 26-28 – er iboende celle- 29 Denne overraskende celle-trengende aktivitet ble vist seg å være en iboende egenskap ved spesialdesignede sink-finger domene, et DNA-bindende plattform som har dukket opp som et kraftig verktøy for målrettet genom en gjennomtrengelig.gineering, 30-32 og anses å være et resultat av den konstellasjon av seks positivt ladede rester på proteinoverflaten. Faktisk har flere DNA-bindende proteiner, inkludert c-Jun og N-DEK blitt vist å ha en iboende evne til å krysse cellemembraner. 33 Mer nylig vårt laboratorium utvidet på disse resultater og viste at cellepenetrerende aktivitet av sink- finger (ZIF) domener kan utnyttes for intracellulær protein levering. Genetisk fusjon av enten en- eller to-finger ZIF domener til spesifikke protein last førte til opptak effektivitet som oversteg mange konvensjonelle celletrengende peptid leveringssystemer. 34 Mest spesielt, gjorde ZIF-mediert levering ikke kompromiss aktiviteten av smeltet enzymatisk last og tilrettelagt høye nivåer av cytosolisk levering. Sammen er disse funnene viser potensialet av ZIF domene for tilrettelegging for effektiv og lettvinte levering av proteiner, og potensielt mer varierte typer av makromolekyler, inn i cellene.
Her er en detaljert steg-for-steg-protokoll på hvordan man implementerer ZIF-teknologi for protein levering i pattedyrceller presentert. Vi har tidligere konstruert en pakke med en-, to-, tre-, fire-, fem- og seks-finger-domener Zif som mangler evnen til å binde DNA, på grunn av substitusjon av hver av de α-heliks DNA-bindingsrester, men er i stand til å levere proteiner i celler 34 (figur 1). Produksjon og transduksjon av Emerald GFP (EmGFP) i HeLa celler ved hjelp av en to-finger ZIF domenet er beskrevet. Denne protokollen er utvidbar til nesten hvilken som helst protein i stand til ekspresjon av oppløselig i Escherichia coli, og nesten en hvilken som helst pattedyrcelletype. Forventede resultater er gitt og strategier for å maksimere ytelsen til dette systemet blir også diskutert.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her er en trinn-for-trinn-protokoll for proteinlevering ved hjelp av celle-gjennomtrengelige sink-finger (Zif) domener presentert. ZIF domene ikke redusere aktiviteten av smeltet enzymatisk last 34; muliggjør for produksjon og rensing av proteiner i utbytter nesten identiske med de som ble observert med ikke-modifisert protein; og kan transportere proteiner og enzymer i en rekke celletyper med effektivitet som overskrider tradisjonelle cellepenetrerende peptid eller protein transduksjon domenesystemer. Samme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (DP1CA174426 til Carlos F. Barbas) og ShanghaiTech University, Shanghai, Kina (til JL). Molekylære grafikk ble generert ved hjelp PyMol.
Materials
| XmaI | New England Biolabs | R0180L | |
| SacI | New England Biolabs | R0156L | |
| Expand High Fidelity PCR system | Roche | 11759078001 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0446S | |
| 4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells | Life Technologies | EC6028BOX | |
| 2x Laemmli Sample Buffer | BioRad | 161-0737 | |
| T4 DNA Ligase | Life Technologies | 15224-017 | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | New England Biolabs | C2527I | |
| IPTG | Thermo Scientific | R0391 | |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 208086-5G | |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-100G | |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-25 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-25G | |
| DTT | Fisher Scientific | PR-V3151 | |
| PMSF | Thermo Scientific | 36978 | |
| Ni-NTA Agarose Resin | QIAGEN | 30210 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516-500ML | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I5513-25G | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | EMO Millipore | UFC900324 | |
| DMEM | Life Technologies | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Life Technologies | 10437-028 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| 24-Well Flat Bottom Plate | Sigma-Aldrich | CLS3527-100EA | |
| Poly-Lysine | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| DPBS, No Calcium, No Magnesium | Life Technologies | 21600010 | |
| Heparan Sulfate | Sigma-Aldrich | H4777 | |
| Trypsin | Life Technologies | 25300054 | |
| Hela cells | ATCC | CCL-2 | |
| Nano Drop ND-1000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | N/A | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 |
References
- Berg, A., Dowdy, S. F. Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules. Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).
- Lindsay, M. A. Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).
- Luo, D., Saltzman, W. M. Synthetic DNA delivery systems. Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).
- Guo, X., Huang, L. Recent advances in nonviral vectors for gene delivery. Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).
- Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy. Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).
- Frankel, A. D., Pabo, C. O. Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell. 55, 1189-1193 (1988).
- Elliott, G., O’Hare, P. Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein. Cell. 88, 223-233 (1997).
- Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes. J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).
- Smith, B. A., et al. Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display. J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).
- Daniels, D. S., Schepartz, A. Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif. J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).
- Karagiannis, E. D., et al. Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library. ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).
- Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r, S., Banta, An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform. ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Arginine grafting to endow cell permeability. ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).
- Cronican, J. J., et al. Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein. ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).
- Panyam, J., Labhasetwar, V. Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).
- Zelphati, O., et al. Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system. J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).
- Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. Protein delivery using engineered virus-like particles. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).
- Voelkel, C., et al. Protein transduction from retroviral Gag precursors. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).
- Sinha, V. R., Trehan, A. Biodegradable microspheres for protein delivery. J. Control Release. 90, 261-280 (2003).
- Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering. PLoS One. 9, e85755 (2014).
- Ramakrishna, S., et al. Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA. Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).
- Fuchs, S. M., Raines, R. T. Polyarginine as a multifunctional fusion tag. Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).
- Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).
- Al-Taei, S., et al. Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors. Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).
- Jones, S. W., et al. Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery. Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).
- Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).
- Carroll, D. Genome engineering with zinc-finger nucleases. 유전학. 188, 773-782 (2011).
- Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases. J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).
- Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins. Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).
- Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies. Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).
- Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).
- Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. Advances in targeted genome editing. Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).
- Cronican, J. J., et al. A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo. Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).
- Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains. ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).
- Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors. ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).
- Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F., Horton, N. C. Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA. J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).
