Génération de cellules souches pluripotentes induites à partir de Frozen Buffy Manteaux en utilisant non-intégration épisomique plasmides

Summary

Cellules souches pluripotentes induites (CISP) représentent une source de tissus spécifiques au patient pour des applications cliniques et la recherche fondamentale. Ici, nous présentons un protocole détaillé pour reprogrammer les cellules humaines périphériques mononucléaires du sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés en CSPi virales sans l'aide de non-intégration des plasmides épisomiques.

Abstract

Les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules souches pluripotentes induites (CISP) en forçant l'expression de quatre facteurs de transcription (Oct-4, Sox-2, KLF-4, et c-Myc), généralement exprimé par les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) . En raison de leur similitude avec les CSEh, CSPi sont devenus un outil important pour la médecine régénérative potentiel spécifique au patient, en évitant les questions éthiques liées aux CSEh. Afin d'obtenir des cellules appropriées pour une application clinique, CSPi gratuitement transgènes doivent être générés pour éviter transgène réactivation, l'expression du gène altéré et la différenciation erronée. En outre, un procédé de reprogrammation est performant et peu coûteux est nécessaire pour obtenir iPSCs suffisantes à des fins thérapeutiques. Compte tenu de cette nécessité, une approche efficace non-intégration plasmide épisomique est le choix préférable pour iPSC dérivation. Actuellement type cellulaire le plus couramment utilisé à des fins de reprogrammation sont les fibroblastes, dont l'isolement nécessite une biopsie tissulaire, un invasive intervention chirurgicale pour le patient. Par conséquent, le sang périphérique humain représente le tissu le plus accessible et moins invasif pour la génération iPSC.

Dans cette étude, un protocole de rapport coût-efficacité et virale sans l'aide de non-intégrant des plasmides épisomiques est signalé pour la génération de iPSCs à partir de cellules mononucléaires périphériques humaines dans le sang (de PBMNCs) obtenus à partir de couches leucocytaires congelés après centrifugation de sang entier et sans séparation en gradient de densité.

Introduction

En 2006, le groupe de Shinya Yamanaka ¹ a démontré pour la première fois que des cellules somatiques de souris et les humains adultes peuvent être convertis en un état ​​pluripotent par l'expression ectopique de quatre facteurs de reprogrammation (Oct-4, Sox-2, KLF-4, et c-Myc), générer les soi-disant cellules souches pluripotentes induites (CISP) ^2. CSPi spécifiques au patient ressemblent étroitement à des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en termes de morphologie, la prolifération et la capacité de se différencier en types de cellules de trois de germe (mésoderme, endoderme et ectoderme) tout en manquant les préoccupations éthiques liées à l'utilisation des CSEh et contournement possible rejet immunitaire ^3. Ainsi, CSPi apparaît comme l'une des sources les plus importantes de cellules spécifiques au patient pour la recherche fondamentale, le dépistage des drogues, la modélisation de la maladie, l'évaluation de la toxicité, et à des fins de médecine régénérative ^4.

Plusieurs approches ont été utilisées pour la génération iPSC: vecteurs d'intégration virale⁽⁵ rétrovirus, les lentivirus ^6), virale non des vecteurs d'intégration (adénovirus ^7), Sendai-virus ^8, transposons BAC ^9, vecteurs épisomiques ^{10, 11} protéines ou de la livraison de l'ARN ^12. Bien que l'utilisation de méthodes de médiation virale peut conduire à l'hypertension reprogrammation de l'efficacité, des vecteurs viraux intégrer dans le génome des cellules hôtes et donc un potentiel mutagenèse par insertion aléatoire, altération permanente de l'expression génique, et la réactivation de transgènes au silence lors de la différenciation ne peut être exclue ^13.

Pour faire CSPi plus sûr pour la médecine régénérative, des efforts ont été faits pour tirer CSPi sans l'intégration de l'ADN exogène dans les génomes cellulaires. Bien que des vecteurs viraux et transposons soumis à accises ont été développés, il est encore difficile de savoir si courtes séquences du vecteur, qui restent inévitablement dans les cellules transduites après excision, et transposase expression, pourraient induire une altération dans la celluleparti- fonctionnent ^13. Malgré sa grande efficacité de reprogrammation, le virus Sendai représente une approche coûteuse et atteindre par-licence préoccupations avec la société qui a développé ce système ont le potentiel pour limiter son application dans les études translationnelles. En outre, la nécessité pour l'introduction directe de protéines et d'ARN nécessite la livraison multiple de reprogrammer des molécules avec les limitations techniques inhérentes Cela introduit, et l'efficacité globale de reprogrammation est très faible ^14. Il faut noter que les méthodes virales libres et non rentables intégration basée sur l'utilisation de plasmides épisomiques ont été rapportés avec succès pour la reprogrammation des fibroblastes de peau ^15. Plus précisément, dans le présent travail, nous avons décidé d'utiliser disponibles plasmides épisomiques gratuitement intégration commerciales, comme indiqué précédemment ^10,15.

À ce jour, les fibroblastes de la peau représentent la plus populaire type de cellule donneuse ^5. Cependant, d'autres sources de cellules ont été successfully reprogrammé en iPSCs y compris ¹⁶ des kératinocytes, des cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse, des cellules ¹⁷ stromales adipeuses ^{18, 19} follicules pileux et les cellules de pulpe dentaire ^20. L'isolement de ces cellules nécessite une intervention chirurgicale, et plusieurs semaines sont nécessaires pour l'expansion in vitro de cellules en vue d'établir une culture de cellules primaires.

Dans cette optique, la sélection de départ type de cellule est critique et il est tout aussi important d'être capable de produire des CSPi à partir de tissus facilement accessibles et moins invasifs tels que le sang. Les cellules mononucléaires de sang de cordon ^(21,22) de CBMNCs périphériques et les cellules mononucléées du sang ^(14,22-24) PBMNCs représentent des sources de cellules appropriés pour la dérivation de iPSCs.

Bien que l'efficacité de reprogrammation PBMNC adulte est de 20 à 50 fois inférieure à celle de CBMNCs ^22, ils restent le type cellulaire le plus commode à des fins d'échantillonnage. Dansfait, PBMNC échantillonnage présente l'avantage d'être très peu invasive, et en plus, ces cellules ne nécessitent pas une vaste extension des expériences in vitro avant de reprogrammation. À ce jour, différents protocoles ont rapporté que PBMNCs après la séparation de gradient de densité peuvent être congelés et décongelés jours à plusieurs mois après congélation et élargis pour quelques jours avant de reprogrammer en CSPi ^22,23. Néanmoins, dans la mesure où nous sommes conscients aucun rapports ont décrit une reprogrammation de PBMNCs de couches leucocytaires congelés. Surtout, buffy coats congelés prélevés sans séparation de gradient de densité représentent des échantillons de sang les plus courantes stockées dans les grandes biobanques à l'échelle des études de population, ce qui représente une piscine facilement accessible du matériel de production iPSC qui évite en outre la collecte d'échantillons.

Nous rapportons ici pour la première fois la génération de CSPi virales libres de couches leucocytaires humains congelés, basé sur un protocole décrit précédemment ^22. DansDe plus, ont été générées à partir de iPSCs PBMNCs congelés obtenus après séparation par gradient de densité, comme un protocole de commande pour les résultats de PBMNC gradient de densité non-purifiés.

Protocol

Des cellules mononucléaires du sang (de PBMNCs) ont été isolés à partir d'échantillons sanguins périphériques humains de donneurs sains après consentement éclairé signé et l'approbation du comité d'éthique de la province du Tyrol du Sud. Des expériences ont été menées en conformité avec les principes énoncés dans la Déclaration d'Helsinki. Toutes les données ont été recueillies et analysées de façon anonyme. 1. Isolement des cellules mononucléaires d…

Representative Results

Dans cette étude, un protocole simple et efficace pour la génération de iPSCs viraux exempts de reprogrammation de PBMNCs isolées à partir de couches leucocytaires congelée après centrifugation du sang total et la comparaison avec une reprogrammation de PBMNCs obtenus après séparation par gradient de densité est rapportée. La figure 1A montre une représentation schématique de le protocole détaillé. Après décongélation, les PBMNCs isolées, montrant une forme typique arrondie, sont dév…

Discussion

Dans le passé, la seule façon d'obtenir des cellules souches pluripotentes humaines porteuses d'une mutation génétique particulière était de recruter les parents subissant un diagnostic génétique pré-implantatoire et de générer des cellules souches embryonnaires à partir de leurs blastocystes rebut ^31,32. En utilisant une approche de reprogrammation, les chercheurs peuvent désormais générer des CSPi de patients porteurs de pratiquement tout le génotype. La possibilité de démarrer à …

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µL Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit