비 통합 에피 솜 플라스미드를 사용하여 냉동 버피 코트에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Summary

유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 임상 응용 프로그램 및 기초 연구에 대한 환자의 특정 조직의 소스를 나타냅니다. 여기서는 비 – 에피 솜 통합 플라스미드를 사용하여 바이러스 프리 iPSCs에 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)를 재 프로그래밍 상세한 프로토콜을 제시한다.

Abstract

체세포 네 개의 전사 인자 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, C-Myc와)의 발현을 강제력에 의해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)으로 재 프로그램 될 수 있고, 전형적으로 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 표명 . 때문에 인간 배아 줄기 세포와의 유사성, iPSCs는 인간 배아 줄기 세포와 관련된 윤리적 문제를 방지, 잠재적 인 환자 맞춤형 재생 의학을위한 중요한 도구가되고있다. 임상 적용에 적합한 세포를 얻기 위해서, 트랜스 프리 iPSCs은 트랜스 활성화, 변화된 유전자 발현 및 분화 잘못을 피하기 위해 생성 될 필요가있다. 또한, 고효율 및 저가의 리 프로그래밍 방법은 치료 목적을 위해 충분한 iPSCs를 유도 할 필요가있다. 이러한 요구를 감안할 때, 효율적인 비 통합 에피 솜 플라스미드 방법은 IPSC 유도를위한 바람직한 선택이 될 것입니다. 현재 프로그래밍을 위해 가장 일반적으로 사용되는 세포 유형이 섬유 아세포는, 분리가있는 난 조직 생검을 요구환자에 대한 nvasive 수술. 따라서, 인간 말초 혈액 IPSC 생성에 가장 접근하고 최소 침습 조직을 나타낸다.

이 연구에서, 비 통합 에피 솜 플라스미드를 이용하여 비용 효율적이고 바이러스가없는 프로토콜은 전혈을 원심 분리 한 후 밀도 구배 분리없이 냉동 버피 코트로부터 얻은 인간의 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs)로부터 iPSCs의 생성을 위해보고된다.

Introduction

2006 년 신야 야마나카 ^하나의 그룹은 성인 쥐와 인간에서 체세포 네 프로그래밍 요소 (10 월 4 삭스-2, KLF-4, 이소성 발현하여 능성 상태로 전환 될 수 있음을 최초로 입증 C-Myc와), 소위 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs) ^2를 생성하는 ^단계를 포함한다. 특정 환자 iPSCs 밀접 형태, 증식 및 세 생식 세포 유형 (중배엽, 내배엽 및 외배엽)로 분화 할 수있는 능력의 관점에서 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)를 닮은 인간 배아 줄기 세포 및 바이 패싱의 용도에 관련된 윤리적 문제 부족한 반면 가능한 면역 거부 ^3. 따라서, iPSCs는 기초 연구, 약물 검사, 질병 모델링, 독성 평가, 재생 의학 목적으로 ⁴ 환자 맞춤형 세포의 가장 중요한 소스 중 하나로 나타납니다.

몇 가지 접근 방법은 IPSC 생성을 위해 사용되어왔다 : 바이러스 통합 벡터를⁽⁵ 레트로 바이러스, 렌티 바이러스 ^6), 바이러스의 비 – 통합 벡터 (아데노 ^7), 센다이 바이러스 ⁸ BAC 트랜스포존 ^9, 에피 솜 벡터 ^{(10), (11)} 단백질 또는 RNA 전달 ^12. 바이러스 – 매개 방법의 사용은 고효율 프로그래밍을 초래할 수 있지만, 바이러스 성 벡터는 숙주 세포에 따라서 전위 랜덤 삽입 성 돌연변이 유발의 게놈 내로 통합 분화 동안 유전자 발현, 및 침묵 유전자의 활성화의 영구 변형 ^(13)을 배제 할 수 없다.

재생 의학을위한 iPSCs 안전하게하려면 노력은 세포 게놈에 외래 DNA의 통합없이 iPSCs를 유도하기 위해 이루어졌다. excisable 트랜스포존 및 바이러스 벡터가 개발되었지만, 필연적 절제술 후 형질 도입 된 세포를 유지하고, 발현 벡터를 트랜스 짧은 시퀀스, 셀 변경을 유도 할 수 있는지에 여전히 불분명울라 ^(13)를 작동합니다. 높은 프로그래밍 효율에도 불구하고, 센다이 바이러스는 병진 연구에서 그 적용을 제한 할 가능성이있는 시스템을 개발 한 회사와 고가의 접근 및 도달 스루 라이센싱 문제를 나타낸다. 또한, 단백질 및 RNA의 직접적인 도입에 대한 필요성이 도입 본질적인 기술적 제한 분자를 재 프로그래밍의 다수의 전달을 필요로하고, 전체 프로그래밍 효율이 매우 낮다 ^(14). 참고로, 에피 솜 플라스미드의 사용을 기반으로 비용 효율적인 프리 – 바이러스 및 비 통합하는 방법이 성공적으로 피부 섬유 아세포 ^(15)의 재 프로그래밍을 위해보고 된 바있다. 이전에 ^{10, 15를보고} 구체적으로, 본 연구에서 우리는, 상용 가능한 통합없는 에피 솜 플라스미드를 사용하기로 결정했다.

지금까지의 피부 섬유 아세포는 가장 인기있는 도너 셀 타입 ^5를 나타낸다. 그러나, 다른 세포 소스 succes에왔다sfully 각질 ^(16), 골수 중간 엽 줄기 세포 ^(17), 지방 기질 세포 ^(18)를 포함 iPSCs로 재 프로그래밍, 머리는 ¹⁹ 여포, 치과 펄프 셀 ^(20). 이러한 세포의 분리는 수술 절차를 필요로하고, 여러 주들은 일차 세포 배양을 설정하기 위해 시험 관내 세포 확장을 위해 필요하다.

이러한 관점에서, 셀형의 개시 선택은 중요하며, 이는 혈액과 같은 쉽게 접근 덜 침습적 조직으로부터 iPSCs를 생성 할 수있는 것이 역시 중요하다. 두 제대혈 단핵구 (CBMNCs) ^{(21, 22)} 및 말초 혈 단핵 세포 (PBMNCs는) ^14,22-24는 iPSCs의 유도를위한 세포의 적당한 공급원을 나타낸다.

성인 PBMNC 리 프로그래밍의 효율이 ²² CBMNCs보다 20-50 배 낮지 만, 이들은 샘플링 목적을 위해 가장 편리한 셀형 남아있다. 에사실, PBMNC 샘플링은 최소 침습되는 장점을 가지며, 또한, 이들 세포는 재 프로그래밍 이전에 시험 관내 실험에서의 광범위한 확장을 필요로하지 않는다. 현재까지, 다른 프로토콜은 밀도 구배 분리 후 PBMNCs 냉동과 해동 일 몇 개월에 동결 후 iPSCs ^{22, 23로} 재 프로그래밍하기 전에 며칠 동안 확장 될 수 있다고보고있다. 그럼에도 불구하고, 지금까지 우리는보고는 냉동 버피 코트에서 PBMNCs의 재 프로그래밍을 설명하지 않은 알고있다. 중요한 것은 밀도 구배 분리없이 수집 냉동 버피 코트 따라서 상기 샘플 수집을 피할 IPSC 생산을위한 재료의 쉽게 액세스 풀을 나타내는 모집단 연구 대규모 바이오 뱅크에 저장된 가장 일반적인 혈액 샘플을 나타낸다.

여기서 우리는 이전에 설명 된 프로토콜 ^(22)에 기초하여, 인간 냉동 버피 코트로부터 처음 바이러스 프리 iPSCs의 발생을보고한다. 에또한, iPSCs이 아닌 밀도 구배 정제 PBMNC 결과를위한 제어 프로토콜로서, 밀도 구배 분리 후의 냉동 PBMNCs로부터 생성 하였다.

Protocol

말초 혈액 단핵 세포 (PBMNCs)는 후 동의서와 남부 티롤 지방의 윤리위원회의 승인을 체결 건강한 기증자의 인간의 말초 혈액에서 분리 하였다. 실험은 헬싱키 선언 표현 원리에 따라 수행되었다. 모든 데이터를 수집하고 익명으로 분석 하였다. 말초 혈액 단핵 세포의 분리 1. (PBMNCs) PBMNCs는 밀도 구배 분리하지 않고, 전혈을 원심 분리 한 후 버피 코트로부터 얻은. <li…

Representative Results

이 연구에서 전혈을 원심 분리 및 밀도 구배 분리가보고 후의 PBMNCs의 프로그래밍과 비교 후에 냉동 버피 코트로부터 분리 PBMNCs의 리 프로그래밍에 의해 바이러스가없는 iPSCs의 생성을위한 간단하고 효과적인 프로토콜.도 1a는의 개략도를 도시 자세한 프로토콜입니다. 해동 후, 통상 둥근 형상을 도시 절연 PBMNCs은, 14 일 동안 특정 혈액 배양 배지 (도 1b)에서 팽창 된 후 에?…

Discussion

과거에는 유일한 방법은 특정 유전자 돌연변이를 운반 인간 다 능성 줄기 세포를 수득하는 착상 전 유전자 진단을받은 부모 모집 및 그 폐기 ^31,32 포배에서 배아 줄기 세포를 생성하는 것이다. 프로그래밍 방식을 사용하여, 연구자들은 지금 거의 모든 유전자형을 들고 환자 iPSCs를 생성 할 수 있습니다. 가능성은 환자 맞춤형 세포 라인에서 시작하고 장애의 병태 생리 및 새로운 치료 방법?…

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µL Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit