Generering av inducerade pluripotenta stamceller från Frozen Buffy Coats använder icke-integrerande Episomalt plasmider

Summary

Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) utgör en källa till patientspecifika vävnader för kliniska tillämpningar och grundforskning. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för att programmera humana perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) som erhållits från frysta gula hinnor till virusfria iPSCs använder icke-integrerande episomala plasmider.

Abstract

Somatiska celler kan omprogrammeras till inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) genom att tvinga uttrycket av fyra transkriptionsfaktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, och c-Myc), typiskt uttryckt av humana embryonala stamceller (hESCs) . På grund av deras likhet med hESCs har iPSCs blivit ett viktigt verktyg för potentiella patientspecifika regenerativ medicin, undvika etiska frågor i samband med hESCs. För att erhålla celler som är lämpliga för klinisk applikation, transgen fria iPSCs behöver genereras för att undvika transgenen reaktive, förändrad genexpression och missriktade differentiering. Dessutom är det nödvändigt med en mycket effektiv och billig omprogrammering metod att härleda tillräckliga iPSCs för terapeutiska ändamål. Med tanke på detta behov, är en effektiv icke-integrerande episomal plasmid strategi att föredra val för iPSC härledning. För närvarande är den vanligaste celltypen som används för omprogrammering syften är fibroblaster, isoleringen av som kräver vävnadsbiopsi, en invasive kirurgisk procedur för patienten. Därför representerar humant perifert blod den mest tillgängliga och minst invasiva vävnad för iPSC generationen.

I denna studie, är en kostnadseffektiv och viral fria protokoll med användning av icke-integrerande episomala plasmider rapporterats för generering av iPSCs från humana perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) erhållna från frysta gula hinnor efter helblod centrifugering och utan densitetsgradient separation.

Introduction

År 2006, den grupp av Shinya Yamanaka ¹ visade för första gången att somatiska celler från vuxna möss och människor kan omvandlas till en pluripotent tillstånd genom ektopisk uttryck för fyra omprogrammering faktorer (okt-4, Sox-2, KLF-4, och c-Myc), alstra de så kallade inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) ^2. Patientspecifika iPSCs liknar nära mänskliga embryonala stamceller (hESCs) i fråga om morfologi, spridning och förmåga att differentiera till de typer tre könsceller (mesoderm, endoderm och ektoderm), medan saknar etiska problem som är förknippade med användningen av hESCs och förbikoppling möjlig immunavstötning ^3. Således iPSCs visas som en av de viktigaste källorna till patientspecifika celler för grundforskning, läkemedelsscreening, sjukdom modellering, utvärdering av toxicitet, och regenerativ medicin ändamål ^4.

Flera tillvägagångssätt har använts för iPSC generationen: virala integrerande vektorer(Retrovirus ^5, lentivirus ^6), viral icke-integrerande vektorer (adenovirus ^7), Sendai-virus ^8, BAC transposoner ^9, episomala vektorer ^10, proteiner ¹¹ eller RNA leverans ^12. Även om användningen av virusmedierad metoder kan leda till hög effektivitet omprogrammering, virala vektorer integreras i genomet hos värdceller och därmed potential slumpmässig insertionsmutationer, inte kan uteslutas permanent förändring av genuttryck, och reaktivering av tystade transgener under differentiering ^13.

För att göra iPSCs säkrare för regenerativ medicin, har ansträngningar gjorts för att härleda iPSCs utan integration av exogent DNA i cellulära genomer. Även om punktskattepliktiga virala vektorer och transposoner har utvecklats, är det fortfarande oklart om korta vektorsekvenser, som oundvikligen kvar i de omvandlade cellerna efter excision, och transposasgenen uttryck, kan ge upphov till förändring i cellular fungera ^13. Trots sin höga omprogrammering effektivitet representerar Sendaivirus en dyr strategi och nå igenom licensproblem med det företag som utvecklat systemet har potential att begränsa dess tillämpning i translationella studier. Dessutom, behovet av direkt införande av proteiner och RNA kräver multipel avgivning av omprogrammering molekyler med de inneboende tekniska begränsningar Detta inför, och den totala effektiviteten omprogrammering är mycket låg ^14. Notera kostnadseffektiva virusfria och icke-integrerande metoder baserade på användning av episomala plasmider har framgångsrikt rapporterats för omprogrammering av hudfibroblaster ^15. Närmare bestämt i detta arbete beslutade vi att använda kommersiellt tillgängliga integrationsfria episomala plasmider, som tidigare rapporterats ^10,15.

Hittills hudfibroblaster representerar de mest populära donator celltyp ^5. Men andra cellkällor varit successfully omprogrammeras till iPSCs inklusive keratinocyter ^16, benmärgs mesenkymala stamceller ^17, fett stromaceller ^18, folliklar håret ¹⁹ och tandmassaceller ^20. Isoleringen av dessa celler kräver kirurgiska ingrepp, och flera veckor behövs för in vitro-cellexpansion i syfte att upprätta en primär cellkultur.

Mot bakgrund av detta är valet av start celltyp kritisk och det är lika viktigt att kunna producera iPSCs från lättillgängliga och mindre invasiva vävnader såsom blod. Båda navelsträngsblod mononukleära celler (CBMNCs) ^21,22 och perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) ^14,22-24 representerar lämpliga källor av celler för härledning av iPSCs.

Även om effektiviteten hos vuxna PBMNC omprogrammering är 20-50 gånger lägre än den för CBMNCs ^22, de förblir det bekväm celltyp för provtagning ändamål. IFaktum är PBMNC provtagning fördelen av att vara minimalt invasiva, och dessutom dessa celler inte kräver omfattande expansion in vitro innan omprogrammering experiment. Hittills har olika protokoll rapporterat att PBMNCs efter densitetsgradient separation kan frysas och tinas dagar till flera månader efter frysning och expanderades för några dagar innan omprogrammering i iPSCs ^22,23. Icke desto mindre, så långt vi är medvetna inga rapporter har beskrivit omprogrammering av PBMNCs från frysta gula hinnor. Viktigt frysta gula hinnor samlats utan densitetsgradient separation representerar de vanligaste blodprover lagras i storskaliga biobanker från befolkningsstudier, vilket motsvarar en lättillgänglig pool av material för iPSC produktion som undviker ytterligare provtagning.

Häri rapporterar vi för första gången genereringen av virusfria iPSCs från humana frysta buffy coats, baserad på en tidigare beskriven protokoll ^22. IDessutom gjordes iPSCs genereras från frysta PBMNCs erhållna efter densitetsgradient separation, såsom en styrprotokoll för de icke-densitetsgradient renade PBMNC resultat.

Protocol

Perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) isolerades från humana perifera blodprover från friska donatorer efter undertecknade informerat samtycke och godkännande av etisk kommitté i provinsen Sydtyrolen. Experiment utfördes i enlighet med de principer som uttrycks i Helsingforsdeklarationen. Alla data samlades in och analyserades anonymt. 1. Isolering av perifera mononukleära blodceller (PBMNCs) PBMNCs erhållen från buffy coats efter helblod centrifugering, utan densitet…

Representative Results

I denna studie en enkel och effektiv protokoll för generering av virusfria iPSCs genom omprogrammering av PBMNCs isolerade från frysta gula hinnor efter helblod centrifugering och jämförelse med omprogrammering av PBMNCs erhållna efter densitetsgradient separation rapporterats. Figur 1A visar en schematisk representation av den detaljerade protokoll. Efter upptining, de isolerade PBMNCs, som visar en typisk rund form, expanderas i specifik blododlingsmedium för 14 dagar (Figur 1B)…

Discussion

Förr i tiden, det enda sättet att få mänskliga pluripotenta stamceller som bär en viss genetisk mutation var att rekrytera föräldrar som genomgår preimplantatorisk genetisk diagnostik och skapa embryonala stamceller från sina kasserade blastocyster ^31,32. Med hjälp av en omprogrammering tillvägagångssätt, kan forskarna nu generera iPSCs från patienter som bär nästan alla genotyp. Möjligheten att starta från en patientspecifik cellinjen och en lättillgänglig källa är mycket viktigt efters…

Materials

Sodium Citrate buffered Venosafe Plastic Tube	Terumo	VF-054SBCS07
Ammodium chloride	Sigma-Aldrich	A9434
Potassium bicarbonate	Sigma-Aldrich	60339
EDTA disodium powder	Sigma-Aldrich	E5134	0.5 M solution
Ficoll-Paque Premium	GE Healthcare Life Sciences	17-5442-02	Polysucrose solution for density gradient centrifugation
Iscove's modified Dulbecco's medium (IMDM)	Gibco	21056-023	No phenol red
Ham's F-12	Mediatech	10-080-CV
Insulin-Transferrin-Selenium-Ethanolamine (ITS -X)	Gibco	51500-056	1X (Stock: 100X)
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031	1X (Stock: 100X)
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960
1-Thioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	Final Concentration at 200 µM
Recombinant Human Stem Cell Factor (SCF)	PeproTech	300-07	100 ng/ml (Stock:100 µg/ml)
Recombinant Human Interleukin-3 (IL-3)	PeproTech	200-03	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Recombinant Human Insulin-like Growth Factor (IGF-1)	PeproTech	100-11	40 ng/ml (Stock: 40 µg/ml)
Recombinant Human Erythropoietin (EPO)	R&D Systems	287-TC-500	2 U/ml (Stock: 50 U/ml)
Dexamethasone	Sigma-Aldrich	D2915	1 μM (Stock: 1 mM)
Human Holo-Transferrin	R&D Systems	2914-HT	100 μg/ml (Stock: 20 mg/ml)
Amniomax II	Gibco	11269016	Medium for cytogenetic analysis
mTeSR1	StemCell Technologies	5850	Medium for iPSC feeder-free culture
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828-028
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122
L-Glutamine (200 mM)	Gibco	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Gibco	11140-050
2-Mercaptoethanol	Gibco	31350-010	0.1 mM (Stock: 50 mM)
Sodium Butyrate	Sigma-Aldrich	B5887	0.25 mM (Stock: 0.5 M)
Recombinant Human FGF basic, 145 aa	R&D Systems	4114-TC	10 ng/ml (Stock: 10 µg/ml)
Y-27632 dihydrochloride	Sigma-Aldrich	Y0503	10 µM (Stock: 10 mM)
Fetal Defined Bovine Serum	Hyclone	SH 30070.03
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution	Merck-Millipore	ES-006-B
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced	BD Biosciences	354230
Collagenase, Type IV	Gibco	17104-019	1 mg/ml (Stock: 10 mg/ml)
Accutase	PAA Laboratories GmbH	L11-007	Cell detachment solution
Mouse Embryonic Fibroblast (CF1)	Global Stem	GSC-6201G	1*106 cells/6 well plate
Plasmid pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hSK	Addgene	27078	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-hUL	Addgene	27080	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Plasmid pCXLE-EGFP	Addgene	27082	1 µg (Stock: 1 µg/µl)
Alkaline Phosphatase Staining Kit	Stemgent	00-0009
Anti-Stage-Specific Embryonic Antigen-4 (SSEA-4) Antibody	Merck-Millipore	MAB4304	1/250
Anti-TRA-1-60 Antibody	Merck-Millipore	MAB4360	1/250
Anti-TRA-1-81 Antibody	Merck-Millipore	MAB4381	1/250
Anti-Oct-3/4 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-9081	1/500
Anti-Nanog Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-33759	1/500
Anti-Troponin I Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-15368	1/500
Anti-α-Actinin (Sarcomeric) Antibody	Sigma-Aldrich	A7732	1/250
Neuronal Class III ß-Tubulin (TUJ1) Antibody	Covance Research Products Inc	MMS-435P-100	1/500
Anti-Tyrosine Hydroxylase (TH) Antibody	Calbiochem	657012	1/200
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse	Molecular Probes	A-11029	1/1000
Alexa Fluor 555 Goat Anti-Rabbit	Molecular Probes	A-21429	1/1000
Ultra-Low Attachment Cell Culture 6-well plate	Corning	3471
Trizol Reagent	Ambion	15596-018	reagent for RNA extraction
SuperScript VILO cDNA Synthesis Kit	Invitrogen	11754050	Reverse transcriptase kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5124
CFX96 Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	185-5195
Experion Automated Electrophoresis System	Bio-Rad	700-7000	Instrument to check RNA integrity
Experion RNA Highsense Analysis kit	Bio-Rad	7007105	Reagent kit to check RNA integrity
Dissecting microscope (SteREO Discovery V12 )	Zeiss	495007
NeonTransfection System 100 µL Kit	Invitrogen	MPK10025	Reagent kit for electroporation
Neon Transfection System	Invitrogen	MPK5000	Instrument used for electroporation
NanoDrop UV/Vis Spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-2000	Instrument for DNA/RNA quantification
EndoFree Plasmid Maxi Kit	Qiagen	12362	Plasmid purification kit