Clonazione e produzione su larga scala di ad alta capacità vettori adenovirali in base al tipo Adenovirus umano 5
Summary
A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.
Abstract
High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.
Introduction
Per applicazioni terapeutiche gene è di grande importanza per evitare effetti collaterali citotossici e immunogenici causate da espressione di proteine virali, il transgene stesso o da proteine virali in arrivo. Adenovirus (adv) sono ampiamente utilizzati per introdurre DNA esogeno in un'ampia varietà di cellule per studiare l'impatto di espressione del transgene 1,2. La versione più avanzata di AdV è rappresentato da adenovirus ad alta capacità (HCAdV) privi di tutte le sequenze codificanti virali 3,4 e offrendo così una capacità di confezionamento fino a 35 kb in combinazione con bassa immunogenicità e bassa tossicità 5-8. Grazie alla loro elevata capacità di confezionamento consentono consegna di grandi o più transgeni utilizzando una singola dose di vettore. Pertanto, essi rappresentano uno strumento prezioso per la comunità di ricerca.
A differenza di prima o di seconda generazione AdV privi dei geni precoci E1 e / o E3 che possono essere facilmente prodotti utilizzando kit commerciali, vector costruzione genoma e virus produzione di HCAdV è più complessa. Il sistema per la costruzione di genomi HCAdV si basa sulla pAdFTC plasmide portando un genoma HCAdV privo di tutte le sequenze codificanti virali e il plasmide shuttle pHM5 9-12. Ogni gene di interesse di fino a 14 basi chilo (kb) può essere clonato nel pHM5 navetta vettore in cui il sito di clonaggio multiplo è affiancato da riconoscimento / fendendo siti degli enzimi di homing Pi- Sce I e I-Ceu I. Pertanto, un gene clonato di interesse può essere rilasciato da PI- consecutivo Sce I e I-Ceu io digerisce per successivo inserimento diretto nelle stesse siti di restrizione presenti nel genoma HCAdV contenuta nel pAdFTC plasmide. Nel pAdFTC il sito di inserimento del transgene situato tra il PI- Sce I e I-Ceu io Decolleté siti è fiancheggiato da riempimento del DNA e le sequenze non codificanti adenovirali necessari per il confezionamento genoma tali ripetizioni terminali come il 5 'e 3' invertita (ITR)ad entrambe le estremità e il segnale di confezionamento a valle del 5'ITR. Il DNA addizionale Stuffer fornisce dimensione ottimale del genoma HCAdV finale che vanno da 27 a 36 kb di assicurare imballaggio efficiente durante la produzione di virus. Poiché pAdFTC è una grande plasmide con un massimo di 45 kb (dipende dalla dimensione del transgene inserito) e l'utilizzo di endonucleasi homing con siti di riconoscimento di DNA lunghe comparabilmente presenta forte legame al DNA, più fasi di pulizia sono necessari durante il trasferimento del transgene dal pHM5 a pAdFTC. Si raccomanda la gestione attenta evitando forze di taglio.
I ITRs del genoma HCAdV si affiancano Not I siti di riconoscimento dell'enzima di restrizione situati immediatamente a monte ea valle 5'ITR del 3'ITR 12. Pertanto, HCAdV può essere sganciato Non io digerisco per la successiva trasfezione del genoma virale nel linea cellulare produttore HCAdV. Si noti che l'utilizzo di enzima di restrizione Not I per relfacilità del genoma virale dal pAdFTC plasmide implica che il transgene introdotto non privo di siti di riconoscimento Not I DNA. Le cellule produttrici basate cellule HEK293 (116 celle) stabilmente esprimono Cre ricombinasi. Per l'amplificazione virus 116 cellule sono co-infettati con un virus helper (HV) che fornisce tutti i geni ADV necessari per la replica e l'imballaggio in trans 3,4. L'alta tensione è un AdV prima generazione con un segnale di imballaggio floxed che viene rimossa durante l'amplificazione virus Cre ricombinasi espressa in 116 cellule 4. Questo assicura che i genomi prevalentemente HCAdV contenenti un segnale di imballo integro sono encapsidated.
Pre-amplificazione del HCAdV viene eseguita effettuando passaggi passaggio in serie in 116 cellule coltivate su una superficie in piastre di coltura dei tessuti. Dopo ogni passaggio particelle virali sono rilasciate dalle cellule infette conducendo tre consecutivi passaggi di congelamento-scongelamento. Con ogni passaggio un numero crescente di cellule sono infettati con1/3 di lisato cellulare dal passaggio precedente. Infine lisato dall'ultima fase di pre-amplificazione viene utilizzato per infettare cellule produttrici coltivate in sospensione in un pallone filatore per larga scala di amplificazione. Virioni sono purificati dalle cellule sospensione eseguendo ultracentrifugazione in una densità di cloruro di cesio gradiente 4,12. Con questa procedura particelle vuote e particelle completamente assemblati vengono separati in due bande distinte. Per concentrare ulteriormente il HCAdV particelle viene eseguita una seconda fase ultracentrifugazione non graduale. Successivamente il gruppo risultante contenente il HCAdV viene raccolto e dializzato contro tampone fisiologico. Preparazioni vettore finali sono caratterizzati in relazione al numero di particelle virali assoluti, particelle infettive e livelli di contaminazione HV. Particelle virali assoluti possono essere determinati mediante lisi particelle virali e misurare l'assorbanza a 260 nm o eseguendo quantitativa real-time PCR (qPCR) 12. Infettività del purparticelle virali da norme possono essere determinate misurando qPCR genomi HCAdV presenti all'interno delle cellule infettate 3 ore dopo l'infezione.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo presentato qui permette la purificazione di vettori HCAdV basati su adenovirus umano di tipo 5 basato su procedure descritte in precedenza 4,12. Il genoma HCAdV all'interno del plasmide pAdFTC è privo di tutti i geni di adenovirus e porta solo le 5'- e 3'ITR e il segnale di confezionamento. In questa strategia l'HV AdNG163R-2 4 offre tutti i geni necessari per la produzione di virus efficiente in trans. Questo offre una capacità di confezionamento di fino a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by DFG grant EH 192/5-1 (A.E.), the EU (E-rare-2) project Transposmart (A.E.), the UWH Forschungsförderung (E.S. and W.Z), and the PhD programme of the University Witten/Herdecke (P.B.). J.L. was supported by a stipend of the Chinese Scholarship council and T.B. and M.G by the Else Kröner-Fresenius foundation (EKFS).
Materials
| I-CeuI | New England Biolabs | R0699S | restriction digest |
| PI-SceI | New England Biolabs | R0696S | restriction digest |
| T4 Ligase | New Engand Biolabs | M0202S | ligation |
| SwaI | New England Biolabs | R0604S | restriction digest |
| NotI | New England Biolabs | R0189S | restriction digest |
| Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290S | dephosphorylation of digested plasmids |
| Hygromycin B | PAN Biotech | P02-015 | selection of CRE expressing 116 cells |
| DMEM | PAN Biotech | P04-03590 | Hek293T cell culture medium |
| Minimal Essential Medium (MEM) Eagle | PAN Biotech | P04-08500 | 116 cell culture medium |
| Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS) | PAN Biotech | P04-36500 | washing of cells, resuspension of cells |
| 250 ml storage bottle | Sigma | CLS430281-24EA | infection of 116 cells grown in suspension |
| 500mL PP CentrifugeTubes | Sigma | CLS431123-36EA | sedimentation of cells from suspension culture |
| Spinner flask | Bellco | 1965-61030 | growth of 116 cells in suspension |
| Ultra Clear Ultracentrifuge tubes | Beckmann Coulter | 344059 | density gradient centrifugation |
| Ultracentrifuge | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| SW-41 rotor | Beckmann Coulter | – | density gradient centrifugation |
| Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane | VWR | 132129 | dialysis tubing |
| ready-to-use dialysis cassettes | Thermo | 66383 | dialysis |
| one shot DH10B electrocompetent E. coli | invitrogen | C4040-52 | transformation of ligation reactions |
| PureYield™ Plasmid Midiprep System | Promega | A2495 | midiprep |
| peqGOLD Tissue DNA Mini Kit | Peqlab | 12-3396-02 | isolation of genomic DNA |
| SuperFect Transfection Reagent | Qiagen | 301305 | tranfection of 116 cells |
| opti MEM (10 % FBS) | Gibco | 31985-062 | transfection of 116 cells |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 170-8882 | q-PCR |
| CFX 96 C1000 touch | Biorad | qPCR machine | |
| Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol | Carl Roth | A156.1 | purification of DNA |
| Cesium chloride | Carl Roth | 8627.1 | density gradient centrifugation |
| sodium acetate 99% | Carl Roth | 6773.2 | DNA precipitation |
| LB medium | Carl Roth | X968.3 | bakterial growth medium |
| ethanol 99,8% pure | Carl Roth | 9065.5 | DNA precipitation and washing |
| SDS 99,5% | Carl Roth | 2326.2 | lysis buffer |
| EDTA | Carl Roth | 8043.2 | lysis buffer |
| Tris-HCl 99% | Carl Roth | 9090.3 | dialysis buffer/ lysis buffer |
| glycerol 99,5% | Carl Roth | 3783.1 | dialysis buffer |
| MgCl2 98,5% | Carl Roth | KK36.2 | dialysis buffer |
| NaCl | Carl Roth | 3957.1 | optional dialysis buffer |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | optional dialysis buffer |
| sucrose | Carl Roth | 9286.1 | optional dialysis buffer |
| Na2HPO4x2H2O | Carl Roth | 4984.2 | optional dialysis buffer |
| 1,5ml tubes | sarstedt | 72,730,005 | storage of virus preparations at -80°C |
References
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