Kloning og storskala produksjon av høykapasitets adenovirusvektorer Basert på Human adenovirus type 5

Summary

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Abstract

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

Introduction

For genet terapeutiske anvendelser er det av stor betydning for å unngå cytotoksiske og immunogene bivirkninger forårsaket av ekspresjon av virale proteiner, transgenet i seg selv eller ved innkommende virale proteiner. Adenovirusvektorer (AdV) er mye brukt for å innføre fremmed DNA inn i en rekke forskjellige celler for å undersøke effekten av transgene uttrykk ^1,2. Den mest avanserte versjonen av AdV er representert ved høykapasitets adenovirusvektorer (HCAdV) mangler alle virus kodende sekvensene ^3,4 og dermed tilby en pakkekapasitet opp til 35 kb kombinert med lav immunogenisitet og lav toksisitet ^5-8. På grunn av deres høye pakkekapasitet de tillater levering av store eller flere transgener ved hjelp av en enkelt vektor dose. Derfor, de representerer et verdifullt verktøy for forskersamfunnet.

I motsetning til første eller annen generasjon AdV mangler de tidlige gener E1 og / eller E3 som enkelt kan produseres ved hjelp av kommersielle kits, vector genom konstruksjon og virusproduksjon av HCAdV er mer kompleks. Systemet for bygging av HCAdV genomer er basert på plasmidet pAdFTC bærer en HCAdV genom blottet for alle virale sekvenser og shuttle plasmid pHM5 ^9-12. Enhver genet av interesse på opp til 14 kilobaser (kb) kan bli klonet inn i shuttle-vektoren pHM5 hvor multiple kloningssete flankert av gjenkjenning / spalte sidene til de målsøkende endonukleaser PI- SCE I og I- Ceu I. Derfor kan et klonet gen frigjøres ved suksessiv PI- SCE I, og I- Ceu I fordøyer for etterfølgende rettet innføring i de samme restriksjonssetene som er tilstede i genomet HCAdV som inneholdes i plasmid pAdFTC. I pAdFTC transgenet innføringsstedet ligger mellom PI- SCE I, og I- Ceu I spaltningsseter er flankert av stuffer DNA, og de ​​ikke-kodende sekvenser som er nødvendig for adenovirus-genom emballasje slik som 5 'og 3' inverterte terminale gjentagelser (Itrs)i begge ender og emballasjen signal nedstrøms for 5'ITR. Den ekstra stuffer DNA gir optimale størrelsen på den endelige HCAdV genomet som strekker seg fra 27 til 36 kb å sikre effektiv pakking under virusproduksjon. Siden pAdFTC er et stort plasmid med inntil 45 kb (avhengig av størrelsen av det innsatte transgenet), og bruken av homing endonukleaser med sammenlign lange DNA-gjenkjenningsseter viser sterk DNA-binding, flere opprenskningstrinn er nødvendig under overføring av transgenet fra pHM5 til pAdFTC. Forsiktig håndtering unngå skjærkrefter anbefales.

De Itrs av HCAdV genomet er flankert av Ikke-restriksjonsenzymgjenkjennelses ligger rett oppstrøms for 5'ITR og nedstrøms av 3'ITR ^12. Derfor kan HCAdV frigis av Not I fordøye for etterfølgende transfeksjon av det virale genomet inn i HCAdV produsent-cellelinje. Legg merke til at bruken av restriksjonsenzymet NotI for relenkel virusgenomet fra plasmidet pAdFTC innebærer at den innsatte transgenet er blottet for Not I DNA-gjenkjenningsseter. De HEK293 celle basert produsent celler (116 celler) stabilt uttrykker Cre rekombinase. For virus forsterkning 116 celler er co-infisert med en hjelper virus (HV) som gir alle AdV gener som trengs for replikering og emballasje i trans ^3,4. HV er en første generasjons AdV med en floxed pakking signal som blir fjernet i løpet av virus forsterkning av Cre rekombinase uttrykt i 116 celler ^4. Dette sikrer at hovedsakelig HCAdV genomer inneholdt et intakt emballasje signal blir innkapslet.

Pre-amplifisering av HCAdV blir utført ved å utføre serielle aging måten i 116-celler dyrket på overflater i vevskulturskåler. Etter hver passering virale partikler blir frigjort fra infiserte celler ved å gjennomføre tre påfølgende fryse-tine-trinn. Med hver passasje økende antall celler som er infisert med1/3 av cellelysat fra den foregående passasje. Endelig lysat fra den siste pre-forsterkertrinnet blir brukt til å infisere produsent celler dyrket i suspensjon i en roterende kolbe for storskala forsterkning. Virioner er renset fra suspensjonsceller ved å utføre ultrasentrifugering i en cesiumklorid densitetsgradient ^4,12. Med denne fremgangsmåten tomme partikler og ferdig montert partikler blir delt opp i to adskilte bånd. For ytterligere å konsentrere HCAdV partiklene en andre ikke-gradvis ultrasentrifugetrinnet utføres. Deretter ble den resulterende bånd som inneholder det HCAdV samles og dialyseres mot en fysiologisk buffer. Endelige vektor forberedelser karakteriseres med hensyn til antall absolutte viruspartikler, smittsomme partikler og HV kontamineringsnivåer. Absolutte virale partikler kan bestemmes ved lysering av virale partikler og måling av absorbansen ved 260 nm, eller ved å utføre kvantitativ real-time PCR (qPCR) ^12. Smittsomhet av pursert viruspartikler kan bestemmes ved måling av qPCR HCAdV genom tilstede i infiserte celler, 3 timer etter infeksjon.

Protocol

1. Konstruksjon av rekombinant HCAdV genomer basert på Plasmid pAdFTC Merk: Alle plasmider har blitt beskrevet tidligere 11,12 og er tilgjengelig på forespørsel. Kloningsprosedyren er skjematisk vist i figur 1. Klone et gen av interesse (GOI) inkludert promotor og polyadenyleringssignalet (PA) i shuttle plasmid pHM5, ved hjelp av en kloning strategiske valget, for å generere pHM5-GOI. MERK: Siden pAdFTC er en relativt stor plasmid, er klassis…

Representative Results

Her representative eksempler for kloning, forsterkning og rensing av HCAdV preparater vises. En oversikt over kloningsstrategien (figur 1), og representative eksempler for kloning og frigivelse av HCAdV genomet ved restriksjonsenzym fordøye er anordnet (figur 2). En typisk begrensning mønster etter utgivelsen av GOI-uttrykk kassett fra pHM5 av PI- SCE jeg og I- Ceu jeg fordøye og påfølgende fenol-kloroform ekstraksjon og EtOH nedb?…

Discussion

Protokollen presenteres her tillater rensing av HCAdV vektorer basert på menneskelige adenovirus type 5 basert på tidligere beskrevne prosedyrer ^4,12. Den HCAdV genom innenfor pAdFTC plasmidet er fri for alle adenovirus gener og bærer bare 5'- og 3'- Itrs og emballasjen signal. I denne strategien HV AdNG163R-2 ^{4 gir} alle nødvendige gener for effektiv virusproduksjon i trans. Dette gir en emballasje kapasitet på opp til 35 kb, noe som klart outcompetes første og andre generasj…

Materials

I-CeuI	New England Biolabs	R0699S	restriction digest
PI-SceI	New England Biolabs	R0696S	restriction digest
T4 Ligase	New Engand Biolabs	M0202S	ligation
SwaI	New England Biolabs	R0604S	restriction digest
NotI	New England Biolabs	R0189S	restriction digest
Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIP)	New England Biolabs	M0290S	dephosphorylation of digested plasmids
Hygromycin B	PAN Biotech	P02-015	selection of CRE expressing 116 cells
DMEM	PAN Biotech	P04-03590	Hek293T cell culture medium
Minimal Essential Medium (MEM) Eagle	PAN Biotech	P04-08500	116 cell culture medium
Dulbecco’s phosphate buffer saline (DPBS)	PAN Biotech	P04-36500	washing of cells, resuspension of cells
250 ml storage bottle	Sigma	CLS430281-24EA	infection of 116 cells grown in suspension
500mL PP CentrifugeTubes	Sigma	CLS431123-36EA	sedimentation of cells from suspension culture
Spinner flask	Bellco	1965-61030	growth of 116 cells in suspension
Ultra Clear Ultracentrifuge tubes	Beckmann Coulter	344059	density gradient centrifugation
Ultracentrifuge	Beckmann Coulter	–	density gradient centrifugation
SW-41 rotor	Beckmann Coulter	–	density gradient centrifugation
Spectrum Laboratories Spectrapor Membrane	VWR	132129	dialysis tubing
ready-to-use dialysis cassettes	Thermo	66383	dialysis
one shot DH10B electrocompetent E. coli	invitrogen	C4040-52	transformation of ligation reactions
PureYield™ Plasmid Midiprep System	Promega	A2495	midiprep
peqGOLD Tissue DNA Mini Kit	Peqlab	12-3396-02	isolation of genomic DNA
SuperFect Transfection Reagent	Qiagen	301305	tranfection of 116 cells
opti MEM (10 % FBS)	Gibco	31985-062	transfection of 116 cells
iQ SYBR Green Supermix	BioRad	170-8882	q-PCR
CFX 96 C1000 touch	Biorad		qPCR machine
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol	Carl Roth	A156.1	purification of DNA
Cesium chloride	Carl Roth	8627.1	density gradient centrifugation
sodium acetate 99%	Carl Roth	6773.2	DNA precipitation
LB medium	Carl Roth	X968.3	bakterial growth medium
ethanol  99,8% pure	Carl Roth	9065.5	DNA precipitation and washing
SDS 99,5%	Carl Roth	2326.2	lysis  buffer
EDTA	Carl Roth	8043.2	lysis  buffer
Tris-HCl 99%	Carl Roth	9090.3	dialysis buffer/ lysis  buffer
glycerol 99,5%	Carl Roth	3783.1	dialysis buffer
MgCl2 98,5%	Carl Roth	KK36.2	dialysis buffer
NaCl	Carl Roth	3957.1	optional dialysis buffer
KH2PO4	Carl Roth	3904.2	optional dialysis buffer
sucrose	Carl Roth	9286.1	optional dialysis buffer
Na2HPO4x2H2O	Carl Roth	4984.2	optional dialysis buffer
1,5ml tubes	sarstedt	72,730,005	storage of  virus preparations at -80°C