In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Gedurende vele jaren heeft het onderzoek naar neurodegeneratieve aandoeningen, zoals ischemische beroerte of traumatisch hersenletsel gericht op de ontwikkeling van neuroprotectieve therapieën die gericht zijn op neuronale overleving in de acute beroerte fase te promoten. De overgrote meerderheid van geneesmiddelen therapieën die zijn gevonden effectief in diermodellen niet wanneer vertaald naar de kliniek. Redenen hiervoor therapeutisch falen omvatten maar zijn niet beperkt tot het ontbreken van aanhoudende geneesmiddeleffecten resulteert in aanhoudende functionele neurologische herstel. Het is dus belangrijk om strategieën te bevorderen hersenen remodeling op de langere termijn te ontwikkelen. Door het bevorderen van neuronale overleving alleen is niet voldoende om succesvol beroerte herstel mogelijk maken, zoals voorgesteld door het grote aantal mislukte neuroprotectie proeven, het stimuleren van neuronale plasticiteit onlangs verkregen groot belang op.
Middelen voor drug delivery zijn intraperitoneale injectie, staart intravasculaire injection, dijbeen injectie, enkele stereotactische injectie van vectoren in de hersenen en bleef constante levering door mini-osmotische pompen. Laatstgenoemde kan omvatten systemische afgifte, wanneer de pomp niet een canule, of die worden orgel gerichte kunnen, zoals we hebben aangetoond voor plaatsing in de hersenen. Met uitzondering van mini-osmotische pompen en het gebruik van virale vectoren, zullen alle andere strategieën fluctuerende geneesmiddelconcentraties induceren. Voor lange termijn experimenten derhalve noodzakelijk om het dier bij de stress van ontvangst frequente injecties. De BBB legt een belangrijke belemmering voor de hersenen opname van eiwitten of geneesmiddelen uit het bloed, waardoor de noodzaak van grote eiwit of geneesmiddel doseringen om therapeutische concentraties in de hersenen te bereiken. Bijvoorbeeld Pellegrini et al. (2013) 5 afgegeven rhEPO door intraperitoneale injectie met een dosis equivalent aan 75 IU / dag voor een dier van 30 g (750 IU / dag voor een 300 g rat). Ter vergelijking, de doelgerichte aflevering van rhEpo naar de hersenen liet ons toe om een veel lagere dosis van 10 IU / dag te gebruiken in onze studie voor een succesvolle beroerte herstel, dat ons in staat om het herstel over een groot tijdsbestek te realiseren tegen een vaste rente van 0,25 pl / uur.
In dit werk hebben we aangetoond de wijze van implanteren van minipompjes met een canule verbonden met de schedel om de plasticiteit bevorderend proteïne rhEPO rechtstreeks te leveren in de ventrikel, waardoor het omzeilen van de BBB. Door deze werkwijze rhEPO bevorderd neurologisch herstel in een aantal manieren, waaronder vermindering van infarctgrootte reductie van gliale littekenvorming en inductie van angiogenese. rhEPO bevorderde ook neuronale overleving en hogere projecties van de contralesional motorische cortex naar de gedenerveerde rode kern en gezicht kernen. De kiemen van de vezels werd onthuld door injectie van de anterograde tract tracer BDA in de motorische cortex (figuren 4A en 5A). Een functioneel correleren met de kiemen van de vezels provided door de verbetering van de motorische vaardigheden (Figuur 5B). Daarnaast hebben we aangetoond dat dezelfde benadering tract tracer injectie kan worden toegepast thalamo-corticale verbindingen door injectie van de retrograde tracer tract FG (Figuur 6B) onthullen.
Bij de bereiding van de mini-osmotische pomp, is het essentieel om de eind- en gebruik van spacers te overwegen. We gebruiken een afstandhouder om de lengte van de naald te reduceren 0,5 mm zoals deze wijze de punt van de naald in contact is met het ventrikel op de aangegeven coördinaten (-0,2 mm caudaal, 0,9 mm lateraal, 2,5 mm dorso ventrale met ten opzichte van bregma). Maar als diepere structuren het doel van het onderzoek, is geen spacers nodig. Evenzo, als een externe afleverpunt gewenst is (bijv., De cortex) en vervolgens meer spacer disks nodig. De katheter moet lang genoeg zijn zodat de pomp niet te dicht bij het hoofd, zoals bewegingen van de MOU zal belemmerense, maar ook niet te lang eenmaal geïmplanteerd lange duur kan de katheter te buigen, waardoor het risico van canule verwijdering verhogen door de natuurlijke beweging van de muis. Een sectie van 2 cm van de katheter geeft zeer goede resultaten in termen van mobiliteit en stabiliteit van het implantaat (Figuren 1 en 2). Incubatie van de pomp bij 37 ° CO / N kan de pomp direct beginnen pompen het geneesmiddel in de hersenen op het moment van implantatie.
In de mini-osmotische pomp implantatie is het essentieel om te verzekeren dat de schedel juist vóór implanteren van de canule wordt gedroogd. Meestal reiniging met 70% ethanol wordt het bot te drogen induceren, maar als continue bloeden wordt gevonden, gelijk aan de schedel voorzichtig met een cauterizer zal volledig drogen. Het is essentieel om te verzekeren dat de invoering van de naald verticale en langzaam mogelijk. Eenmaal in positie, en terwijl de lijm droogt, het plaatsen van de vinger op de top van de canule voorkomt dat zijwaartse ovre van de schedel. Speciale aandacht moet worden gegeven aan de wond en de plaatsing van de canule. Het is belangrijk dat de insnijding niet wordt uitgevoerd precies boven de middellijn van de schedel maar enigszins naar rechts. Bij het sluiten van de wond indien de incisie werd gemaakt in de middellijn, de huid zal worden overbelast, waardoor het risico van wondopening verhogen. Het maken van de insnijding aan één zijde iets zal de hechting punten om vanaf het hoogste punt van de canule. Bijgevolg zal er minder spanning op de hechtdraad punten en de wond goed te genezen. De dieren moeten alleen worden gekooid en gecontroleerd elke dag, vooral tijdens de eerste 10-15 dagen na de implantatie. Bij wonddehiscentie, wonden moeten zo snel mogelijk gesloten. Als de canule wordt verwijderd of het dier weer een infectie experiment moet worden beëindigd. Re-implantatie van de canule wordt afgeraden. Het is zeer belangrijk voor een succesvolle implantatie voldoende hoeveelheden weefsel ad gebruikenhesive (niet te veel!) als het degradeert het bot en verhoogt het risico van canule verwijderd. Echter het gebruik van te weinig kleefmiddel wordt evenmin de canule bevestigd aan het bot vast te houden. De mini-osmotische pompen kunnen uitvoeren medicijnen opgelost in een grote verscheidenheid van stoffen als enige beperking dat deze het oplosmiddel biocompatibel. Bovendien, aangezien het volume klein (200 ui) moet men bepalen of de concentratie die nodig is voor het experiment geschikt en precipitatie veroorzaken in de pomp.
Darmkanaal tracing met ofwel anterograde of retrograde tracers is een zeer goed gevestigde techniek om de hersenen connectiviteit en plasticiteit te bestuderen. Zorg moet worden gegeven aan het gebruik stereotactische frames bij het injecteren om nauwkeurigheid op gericht het hersengebied men wil bestuderen (bijv injectie te voorkomen op het corpus callosum bij het inspuiten van de cortex).
Voor alle chirurgische ingrepen en om de pijn te verminderen enontsteking, moeten de dieren behandeld met 0,1 mg / kg buprenorfine voor de interventie en Caprofen bij 4 mg / kg eenmaal per dag gedurende drie dagen na de ingreep.
Kortom, deze benadering levert een goede hulpmiddel om invloed van eiwitten of farmacologische samenstelling in de beschadigde brein, die een werkwijze die goed geschikt is voor onderzoek naar hersenplasticiteit.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |