In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
몇 년 동안, 허혈성 뇌졸중이나 외상성 뇌 손상과 같은 신경 퇴행성 조건에 대한 연구는 급성 뇌졸중 단계에서 신경 세포의 생존을 촉진하는 것을 목표로 신경 치료의 개발에 초점을 맞추고있다. 병원에 번역 할 때 발견 된 약물 치료의 대부분은 실패 설치류 모델에서 효과가 있습니다. 이 치료 실패에 대한 이유를 포함하지만 기능적인 신경 학적 회복을 지속의 결과로 지속적인 약물 효과의 부족으로 제한되지 않습니다. 그것은 장기적으로 뇌의 리모델링을 촉진 전략을 개발하는 것이 중요하다. 신경 생존의 촉진만으로는 성공적인 뇌졸중 회복을 허용하기에 충분하지 않기 때문에 실패 신경 시험의 다수에 의해 제안 된 바와 같이, 신경 가소성의 자극은 최근 주요 관심 분야를 획득했다.
약물 전달되어 복강 내 주사, 꼬리 혈관 나는 수단njection, 대퇴 주입, 단일 정위 뇌에 벡터의 주입 및 miniosmotic 펌프에 의해 일정하게 배달을 계속했다. 펌프 뉼러가 없거나 우리가 뇌에 전달하기 위해 도시 한 바와 같이, 장기 지향 될 수있는 경우에 후자는, 전신 전달을 포함 할 수있다. miniosmotic 펌프의 예외 및 바이러스 벡터를 사용하여, 모든 다른 전략은 약물 농도 변동을 유도 할 것이다. 장기간 실험에 따라서 그것은 빈번한 주사를받는 동물에게 스트레스를 제출할 필요하게된다. BBB는 뇌에서의 치료 농도를 달성하기 위해 큰 단백질 또는 약물 투여의 필요성의 결과, 혈액에서 단백질이나 약물의 뇌 침투를위한 중요한 장애물을 부과한다. 예 페예 그리니 등 알하십시오. 30g (300g 쥐 750 IU / 일)의 동물 75 IU / 일에 해당하는 용량으로 복강 내 주사에 의해 rhEPO로 전달 (2013) 5. 이에 비해, rhEp 전달을 타겟팅뇌에 O를 우리가 0.25 μL / hr의 고정 금리에 큰 시간 스케일을 통해 복구를 달성 할 수있었습니다 성공적으로 뇌졸중 복구를위한 연구에 10 IU / 일의 훨씬 낮은 복용량을 사용하는 것을 허용했다.
본 연구에서 우리는 따라서 BBB를 우회 뇌실에 직접 소성 촉진 rhEPO로 단백질을 제공하기 위해 두개골에 접속을 햄스터 뉼러와 주입 방법을 도시하고있다. 이 방법에 의해, rhEPO로는 경색 크기의 축소, 아교 흉터 형성의 감소 및 혈관 형성의 유도를 포함한 다수의 방식으로 신경 회복을 촉진. rhEPO로는 신경 세포의 생존을 촉진하고 denervated 빨간 핵과 얼굴 핵으로 contralesional 운동 피질에서 예측 증가했다. 섬유의 발아는 운동 피질 (도 4A 및 5A)에 선행 성 요로의 추적 BDA의 주입에 의해 밝혀졌다. 섬유의 발아에 기능적인 상관 관계는 홍보입니다운동 능력의 향상 (그림 5B)에 의해 ovided. 또한, 우리는 요로 트레이서 주입에 대해 동일한 방법이 역행 요로 트레이서 FG (도 6b)의 주사에 의해 thalamo 피질 연결 공개 적용될 수 있음을 보여 주었다.
miniosmotic 펌프의 제조에있어서, 상기 목표점과 스페이서의 사용을 고려하는 것이 중요하다. 우리는와, 0.9 mm 폭, 바늘의 매우 끝 주어진 좌표 뇌실 접촉 (-0.2 mm 꼬리에 이러한 방식으로 0.5mm의 2.5 mm 배측 복부를 바늘의 길이를 줄이기 위해 하나의 스페이서를 사용하여 브레 그마에 대해). 깊은 구조 연구의 대상이다 그러나 경우, 다음에는 스페이서가 필요하지 않습니다. 이상의 외부 배달 지점이 필요한 경우 마찬가지로, (예., 피질), 다음 더 스페이서 디스크가 필요합니다. 펌프가 머리에 너무 가까이되지 않도록이 양해 각서 (MOU)의 움직임을 방해하므로 카테터는 충분히 길어야한다SE는, 또한 너무 오래 같이 한번 주입 된 과도한 길이 따라서 마우스의 자연스러운 움직임으로 뉼러 제거의 위험성을 증가시키는, 카테터가 구부러 발생할 수있다. 카테터 2cm의 부분은 이동성과 임플란트의 안정성 (도 1 및 2)의 관점에서 아주 양호한 결과를 준다. 37 ° CO / N에서 펌프의 배양은 펌프가 즉시 이식의 순간에 뇌에 약물을 펌핑 시작할 수 있습니다.
miniosmotic 펌프 주입 그것은 두개골이 제대로 정맥을 이식하기 전에 건조되는 것을 보장하는 것이 중요합니다. 일반적으로 건조 뼈를 유도 할 것이다 70 % 에탄올로 청소하지만, 지속적인 출혈이 발견되면, cauterizer 부드럽게 두개골을 터치하면 완전히 건조합니다. 이 바늘의 도입 가능한 수직 및 느린 것을 보장하는 것이 중요하다. 위치 및 접착제가 건조되는 동안 한번 뉼러 위에 손가락을두면 OV 옆으로 움직이는 것을 방지두개골을 어. 특별한주의 캐 뉼러의 상처 및 배치에 주어져야한다. 이는 절개 정확히 두개골의 중간 라인 위에하지만 약간 우측으로 수행되지 않는 것이 중요하다. 상처를 닫을 때 절개 중간 배관에서 수행 된 경우, 피부 창상 따라서 개구부의 위험을 증가 심하게 잡아 것이다. 한쪽으로 약간 절개 만들기 봉합사 포인트 뉼러의 높은 부분으로부터 멀리 할 수 있도록한다. 결과적으로이 봉합사 포인트 장력에 덜되며 상처가 제대로 치유 할 것이다. 동물은 혼자 갇힌 특히 이식 후 첫 10~15일 동안 매일 확인해야합니다. 권취 열개시, 상처는 가능한 빨리 폐쇄되어야한다. 캐 뉼러가 제거 또는 동물이 감염을 제시하는 경우, 실험을 종료한다. 캐 뉼러의 재 주입하지 않는 것이 좋습니다. 성공적인 이식 조직이 광고의 충분한 양을 사용하는 것이 매우 중요, 접착 테이프 (너무 많이!)는 뼈를 저하와 정맥 제거의 위험을 증가로. 그러나 또한 뼈에 부착 된 정맥을 보유하지 너무 작은 접착제를 사용. miniosmotic 펌프는 용매가 생체 적합성 이에 만 한정되는, 물질의 다양한 약물 용해를 수행 할 수있다. 또한, 음량이 작은 것을 소정의 (200 μL) 중 하나는 실험에 필요한 농도가 적합한 지 여부를 결정해야하고 펌프 내부에 침전을 유발하지 것이다.
선행 성 또는 역 행성 중 하나 추적기와 추적 기관은 뇌의 연결 및 소성을 연구하는 매우 잘 확립 된 기술이다. 하나 공부하고자하는 뇌 영역을 대상에 정확성을 기하기 위해 주입 할 때는주의가 사용 정위 프레임에 부여해야합니다 (피질을 주입 할 때 즉, 뇌량에 주입을 방지하기 위해).
모든 수술 개입과 통증을 감소시키기 위하여 및염증은, 동물의 개입 후 3 일 동안 / kg을 하루에 한 번 4 밀리그램의 개입과 Caprofen 전에 0.1 ㎎ / ㎏ 부 프레 놀핀으로 처리해야한다.
결론적으로,이 접근법은 또한 뇌 가소성 연구에 적합 방법을 나타내는 부상 뇌에서 단백질 또는 화합물의 약물 학적 효과를 연구하기위한 적절한 수단을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |