Geselecteerde Reaction Monitoring Massaspectrometrie voor Absolute Protein kwantificering
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
Proteomische experimenten massaspectrometrie (MS) gebruikt kan worden ontworpen om hetzij niet-gerichte (shotgun) of gerichte methoden. Discovery proteomics in het algemeen via bottom-up shotgun MS, hetzij een traditionele data-afhankelijke acquisitiemodus, of door één van de recent ontwikkelde data-onafhankelijke technieken (bijvoorbeeld MS E, SWATH) 1,2. Shotgun proteomics is een krachtig hulpmiddel voor high-throughput peptide identificatie en relatieve kwantificatie, maar het is doorgaans ongeschikt voor absolute kwantificering of targeting kleine gedefinieerd sets (~ tientallen) van eiwitten. De MS methode meestal gebruikt voor gerichte proteomics is selected reaction monitoring (SRM) vanwege zijn hoge gevoeligheid, snelheid en dynamisch bereik 3-5. Alternatieven voor SRM omvatten parallelle reactie monitoring, die gebruik maakt van een hoge resolutie, volledige MS scannen 6.
SRM wordt gewoonlijk uitgevoerd met een nano-flow galmsed-phase high-performance liquid chromatography (nano-RP-LC) instrument gekoppeld met een nano-electrospray ionisatie (nano-ESI) ion source verbonden met een drievoudige quadrupool massaspectrometer (QqQ-MS). In een typisch experiment worden monstereiwitten proteolytisch geknipt en de resulterende peptiden chromatografisch gescheiden gedesorbeerd en geïoniseerd. De resulterende voorloper ionen m / z gefilterd door de eerste quadrupool (Q1) en gefragmenteerde in de tweede quadrupool (Q2) door botsing ze met een botsing gas. Het resulterende fragment ionen m / z-gefilterd in de derde quadrupool (Q3) en gekwantificeerd met een dynode. Elke precursor en fragment ionenpaar wordt aangeduid als een overgang, en elke overgang wordt gecontroleerd op een bepaalde periode (de wachttijd; meestal 2-50 msec). In LC-SRM, de QqQ-MS wordt naar het vooraf gedefinieerde lijst van overgangen (de duty cycle typisch ≤3 sec) en een chromatogram van elke overgang wordt geproduceerd.
Alternatieve strategven voor eiwithoudende kwantificering maken gewoonlijk gebruik van immunoassays zoals dot blots, Western blots, ELISA's, antilichaam microarrays, omgekeerde fase proteïne microarrays, microfluïdische immunoassays, digitale ELISA en microbolletjes gebaseerde immunoassays 7. De beste immunoassays kunnen aanzienlijk gevoeliger dan LC-SRM en monsterdoorvoer immunoassays aanzienlijk hoger dan die van LC-SRM 5 zijn. Echter, de ontwikkeling immunoassays duur en / of tijdrovend en de resulterende assays kunnen kwetsbaar voor kruisreactiviteit en / of interferentie, onverenigbaar met cel / weefsel lysis / homogeniseren methoden en / of niet vatbaar multiplexen 5,8. Sommige van deze problemen kunnen worden aangepakt door het koppelen van antilichaam en MS-gebaseerde technieken. Zo kunnen doeleiwitten worden verrijkt met behulp van immunoprecipitatie voorafgaand aan proteolyse en LC-SRM 9-12. Als alternatief kan de SISCAPA techniek maakt gebruik van immunoprecipitatie na proteolyse in het peptide level 13,14. Naast strategieën immunoenrichment, kan immunodepletie hoge overvloed eiwitten worden gebruikt om LC-SRM gevoeligheid te verhogen door het verminderen van interferentie door coeluting analyten 15,16.
MS-eiwitten gekwantificeerd kan worden onderverdeeld in relatieve en absolute kwantificatie en eveneens in-label vrij en stabiele isotopen (bijvoorbeeld metabolisch merken, chemische labeling en zware-gemerkt eiwit en peptide interne standaarden). Label-free technieken kunnen nuttig zijn voor de relatieve eiwit kwantificatie zijn, maar zijn niet geschikt voor nauwkeurige absolute kwantificatie. Ter vergelijking zijn labeltechnieken foutenbronnen bij monstervoorbereiding en MS variantie verminderd en worden vaak gebruikt voor relatieve kwantificatie eiwit 17. Bijvoorbeeld, stabiele isotoop gemerkte proteoom (SILAP) standaarden bereid met een gekweekte menselijke cellijn ingeschakeld relatieve kwantificering van potentiële biomarkers via LC-SRM van humaan serum 18. Accurate absolute eiwit kwantificering door MS vereist dat gezuiverd, gekwantificeerd, isotopisch gemerkt eiwit of peptide interne standaarden worden spiked-in biologische monsters voorafgaande aan MS. De opname van zware isotoop gelabelde interne standaarden in een LC-SRM workflow maakt absolute kwantificatie waarvan is aangetoond zeer reproduceerbare en overdraagbaar laboratoria 16,19 zijn.
Stabiele isotopen gelabelde interne standaarden voor de absolute kwantificering van eiwit MS omvatten peptide standaarden bereid met vaste fase synthese 20, eiwitten uit aaneengeschakelde protease splitsbare peptide standaarden 21 en full-length eiwitstandaards 22. Doelproteïne covalente modificatie en onvolledige monstervoorbereiding (dwz onvolledige sample lysis en homogenisering, en onvolledige eiwit oplosbaar, denaturatie, alkylering en proteolyse) kan accurate kwantificering ondermijnen. Interne pProtein normen het minst waarschijnlijk worden beïnvloed door de meeste van deze potentiële problemen, maar deze zijn meestal de meest moeilijk te bereiden. Een alternatief is om elk doelwit eiwit met meerdere interne peptide standaarden die zijn ontworpen om amino- en carboxy-eindstandige natieve flankerende resten omvatten analyseren. Ongeacht welk type interne standaard wordt gebruikt, moet worden spiked-in biologische monsters in een zo vroeg punt tijdens de voorbehandeling mogelijk. Ook moet meerdere monstervoorbereiding technieken (bijvoorbeeld verschillende denaturatie omstandigheden) worden getest. Het gebruik van meerdere orthogonale experimentele technieken (experimentele cross-validatie) is een haalbare strategie voor het overwinnen van de meeste potentiële kwantificering daagt 23-25.
LC-SRM kwantificering van eiwitten is een zeer flexibele techniek die is gebruikt in vele verschillende toepassingen. Met name is het gebruikt om peptide en proteïne biomarkers studie binnenklinische monsters zoals serum, kern biopsies en naaldopzuigingen 5. LC-SRM is ook gebruikt om de stoichiometrie van eiwitcomplexen 5,26 meten, botulinum neurotoxinen 27 detecteren, te kwantificeren proteïne fosforylatie dynamiek binnen signaalwegen 5 en wijzigingen in eiwitconformatie 28 kwantificeren.
Ons laboratorium gebruikt LC-SRM de signalering eiwitten die chemotaxis van macrofagen mediëren de ontwikkeling van chemotaxis traject simulaties ondersteunen kwantificeren. De algemene regeling van het protocol (figuur 1) begint met de rangschikking van de voorlopige targetpeptiden. Vervolgens worden ruwe peptide externe standaarden gesynthetiseerd en LC-SRM assays voor kwalitatieve analyses van biologische monsters te ontwikkelen. Als het biologisch monster afgeleid doelwit peptide wordt gedetecteerd, worden gezuiverd heavy-gelabelde interne peptide normen opgesteld voor de kwantitatieve LC-SRM. Dit protocol kan worden gebruikt om ACcurately kwantificeren eiwitten uit diverse biologische monsters, en onderzoeken van diverse eiwit targets ondersteunen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Absolute eiwit kwantificering is essentieel voor een zeer divers aanbod van biomedische toepassingen zoals biomarker validatie en signaaltransductiepad modellering. Onlangs, gerichte proteomics met behulp van LC-SRM heeft geprofiteerd van verbeteringen in tal van technologieën, waaronder peptide standaard voorbereiding, HPLC, QqQ-MS en LC-SRM data-analyse. Bijgevolg is het uitgegroeid tot een krachtig alternatief voor immunoassays. Immunoassays kunnen zeer gevoelig en high-throughput, maar ontwikkeling van een robuust …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
References
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
- Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
- Wild, D. . The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , (2013).
- Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
- Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
- Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
- Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
- Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
- Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
- Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
- Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
- Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
- Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
- Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. . Peptide synthesis and applications. , (2013).
- Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
- Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2001).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2013).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
- Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
- Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
- Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
- Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
- Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
- Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
- Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
- Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
- Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
- Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
- Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
- Alterman, M. A., Hunziker, P. . Amino acid analysis : methods and protocols. , (2012).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
- Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
- Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
- Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
- Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
- Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, S5 (2012).
- Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
- Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
- Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
- Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
- Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. . Mol Cell Proteomics. , .
