Microfluidic genipina Deposición Técnica de Cultura extendido de micropatterned vasculares musculares Thin Films

Summary

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Abstract

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.

Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

Introduction

Las enfermedades vasculares, tales como vasoespasmo cerebral ^1,2, hipertensión ^{3, 4} y la aterosclerosis, se desarrollan lentamente, son típicamente de naturaleza crónica, e implican disfuncional fuerza generación por las células del músculo liso vascular (CMLV). Nuestro objetivo es estudiar estos lento que progresan disfunciones vasculares utilizando métodos in vitro con un mayor control de las condiciones experimentales que en modelos in vivo. Hemos desarrollado previamente películas finas musculares vasculares (vMTFs) para la medición de la contractilidad funcional de in vitro diseñados tejidos cardiovasculares ^5, pero este método se ha limitado a relativamente estudios a corto plazo. A continuación, presentamos una técnica de modificación del sustrato que se expande nuestra técnica anterior vMTF para mediciones a largo plazo.

Mientras que el endotelio es también crítico en la función vascular en general, laminillas arterial ingeniería proporcionan un sistema modelo útil para evaluar los cambios en vascularcontractilidad durante la progresión de la enfermedad. Para diseñar un modelo de tejido de la enfermedad vascular funcional, tanto la estructura y la función de la lámina arterial, la unidad contráctil básico de la embarcación, se debe recapitula con alta fidelidad. Laminillas arterial son láminas concéntricas, circunferencialmente alineados de CMLV contráctiles separadas por láminas de elastina ^6. La impresión por microcontacto de (ECM), las proteínas de la matriz extracelular sobre sustratos de polidimetilsiloxano (PDMS) se ha utilizado anteriormente para proporcionar señales de orientación para la organización del tejido para imitar alineado tejido cardiovascular ^5,7-10. Sin embargo, los tejidos modelados utilizando impresión por microcontacto puede perder la integridad después de 3-4 días de cultivo, lo que limita su aplicabilidad en estudios crónicos. Este protocolo proporciona una solución a este problema mediante la sustitución de las técnicas de impresión por microcontacto anteriores con una nueva técnica de deposición de microfluidos.

Genchi et al. PDMS sustratos modificados con genipina y found prolongada viabilidad de miocitos hasta un mes en la cultura ^11. Aquí, se utiliza un enfoque similar para extender la cultura de las células del músculo liso vascular estampadas en PDMS. Genipina, un derivado hidrolítica natural de la fruta gardenia, es un candidato deseable para la modificación de sustrato debido a su toxicidad relativamente baja en comparación con agentes de reticulación similares y su creciente uso como un biomaterial en los campos de la reparación de tejidos y la modificación ^12,13 ECM ^{14, 15.} En este protocolo, la fibronectina se utiliza como una señal de orientación celular, como en métodos de impresión por microcontacto anteriores; sin embargo, genipina se deposita sobre PDMS sustratos antes de patrón fibronectina. Por lo tanto, como las células degradan la matriz de estampado, ECM recién sintetizado a partir de CMLV adjuntos se puede unir al sustrato PDMS genipina-revestido.

Este protocolo utiliza un dispositivo de suministro de microfluidos para el de dos pasos genipina y ECM deposición. El diseño de la microfluidos imita dispositivo microcopatrones de impresión ntact utilizados para laminillas arterial ingeniería en estudios previos ^16. Por lo tanto, esperamos que este protocolo para dar imita laminillas arterial que recapitular con éxito el alineado altamente en la estructura y la función contráctil vivo de laminillas arterial. También evaluamos la contractilidad del tejido que confirmar que genipina es un compuesto de modificación sustrato adecuado para largo plazo en modelos de enfermedades vasculares in vitro.

Protocol

Nota: El objetivo de este protocolo es para construir y utilizar una película vascular musculares delgados (vMTF) con la estructura mostrada en la Figura 1 para evaluar la contractilidad durante el cultivo prolongado de células de músculo liso vascular (CMLV) sobre sustratos de PDMS. Para prolongar la viabilidad CMLV, utilizamos la genipina compuesto reticulante. Los sustratos para estos vMTFs están diseñados para analizar la contractilidad del tejido desarrollado por Grosberg et al. …

Representative Results

El objetivo principal de este trabajo fue extender la viabilidad de CMLV micropatterned sobre sustratos PDMS hidrofóbicas. Esto se logró mediante la incorporación de un sistema de entrega de microfluidos para depositar genipina modelado y fibronectina en PDMS (Figura 1). La deposición de proteínas ECM utilizando la entrega de microfluidos dio de alta transferencia de la fidelidad de la pauta canal con PDMS desnudas entre líneas de genipina y fibronectina (Figura 1D). Las células …

Discussion

A continuación, presentamos un protocolo que se basa en la tecnología vMTF desarrollado previamente, lo que permite tiempos de experimentación extendidos más típica de las vías de enfermedades vasculares crónicas ^1,23,24. Para lograr esto, micropatrón genipina, que ha sido previamente demostrado para proporcionar funcionalización a largo plazo de sustratos PDMS ^11, utilizando una técnica de deposición de microfluidos para producir laminillas arterial Engineered con la mejora de la viabil…

Materials

Coverslip staining rack	Electron Microscopy Sciences	www.emsdiasum.com/	72239-04	Alternative coverslip rack may be used
Microscope cover glass – 25 mm	Fisher Scientific, Inc.	www.fishersci.com	12-545-102	Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	#21458	Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation
1-butanol	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	360465	Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used
Spincoater	Specialty Coating Systems, Inc.	www.scscoatings.com		SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Alternative distributor may be used
Fluorescent microbeads	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	17151	Alternative brand and/or larger size may be used
Silicon wafers	Wafer World, Inc.	www.waferworld.com	2398	Alternative brand and/or size may be used
Photoresist	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height
Contact mask aligner	Suss MicroTec	www.suss.com		MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure
Developer	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 Developer; Hazard: flammable
Tridecafluro-trichlorosilane	UCT Specialties, Inc.	www.unitedchem.com	T2492	Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. )
Surgical biopsy punch	Integra LifeSciences Corp.	www.miltex.com	33-31AA-P/25	Alternative brand and/or size may be used
Genipin	Cayman Chemical	www.caymanchem.com	10010622	Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
1X phosphate buffered saline	Mediatech, Inc.	www.cellgro.com	21-031-CV	Alternative brand may be used
Fibronectin	Corning, Inc.	www.corning.com	356008	Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Inc.	www.lifetechnologies.com	15140-122	Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same
Umbillical artery smooth muscle cells	Lonza	www.lonza.com	CC-2579	Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly
Tyrode's solution components	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	various	Alternative brand may be used for mixing solution
Stereomicroscope	Zeiss	www.zeiss.com	4350020000000000	SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used
Temperature-controlled platform	Warner Instruments	www.warneronline.com	641659; 640352; 641922
Endothelin-1	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	E7764-50UG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained
HA-1077	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	H139-10MG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained