Mikrofluidumanordning Genipin avsättningsteknik för Extended kultur av Micropatterned Kärl Muskulös Thin Films

Summary

We present a method for microfluidic deposition of patterned genipin and fibronectin on PDMS substrates, allowing extended viability of vascular smooth muscle cell-dense tissues. This tissue fabrication method is combined with previous vascular muscular thin film technology to measure vascular contractility over disease-relevant time courses.

Abstract

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular behaviors on disease-relevant time scales. Previously, microcontact printing has been used to fabricate two-dimensional functional arterial mimics through patterning of extracellular matrix protein as guidance cues for tissue organization. Vascular muscular thin films utilized these mimics to assess functional contractility. However, the microcontact printing fabrication technique used typically incorporates hydrophobic PDMS substrates. As the tissue turns over the underlying extracellular matrix, new proteins must undergo a conformational change or denaturing in order to expose hydrophobic amino acid residues to the hydrophobic PDMS surfaces for attachment, resulting in altered matrix protein bioactivity, delamination, and death of the tissues.

Here, we present a microfluidic deposition technique for patterning of the crosslinker compound genipin. Genipin serves as an intermediary between patterned tissues and PDMS substrates, allowing cells to deposit newly-synthesized extracellular matrix protein onto a more hydrophilic surface and remain attached to the PDMS substrates. We also show that extracellular matrix proteins can be patterned directly onto deposited genipin, allowing dictation of engineered tissue structure. Tissues fabricated with this technique show high fidelity in both structural alignment and contractile function of vascular smooth muscle tissue in a vascular muscular thin film model. This technique can be extended using other cell types and provides the framework for future study of chronic tissue- and organ-level functionality.

Introduction

Vaskulära sjukdomar, såsom cerebral vasospasm ^1,2, hypertoni ³ och ateroskleros ^4, utvecklas långsamt, är typiskt kronisk karaktär, och involverar dysfunktionella kraft-generering av vaskulära glatta muskelceller (VSMC). Vi strävar efter att studera dessa långsamt progredierande kärl dysfunktioner använder in vitro-metoder med bättre kontroll av experimentella betingelser än i in vivo-modeller. Vi har tidigare utvecklat kärlmuskel tunna filmer (vMTFs) för mätning av funktionella kontraktilitet av in vitro konstruerade kardiovaskulära vävnader ^5, men denna metod har varit begränsad till relativt korttidsstudier. Här presenterar vi ett substrat modifiering teknik som utökar vår tidigare vMTF teknik för långtidsmätningar.

Medan endotel är också avgörande för övergripande kärlfunktionen, konstruerad arteriell lameller ger ett användbart modellsystem för bedömning av förändringar i vaskulärkontraktilitet under sjukdomsprogression. För att konstruera en funktionell kärlsjukdom vävnadsmodell, både struktur och funktion av artärlamellen, den grundläggande kontraktila enhet av fartygets måste rekapituleras med high fidelity. Arterial lameller är koncentriska, periferiellt inriktade ark kontraktila VSMC åtskilda av ark av elastin ^6. Mikrokontakttryckning av extracellulärt matrix (ECM) proteiner på polydimetylsiloxan (PDMS) substrat har tidigare använts för att tillhandahålla vägledning ledtrådar för vävnadsorganisation för att efterlikna i linje kardiovaskulär vävnad ^5,7-10. Men vävnader mönstrad med hjälp microcontact utskrift kan förlora integriteten efter 3-4 dagar i kultur, vilket begränsar deras användbarhet i kroniska studier. Detta protokoll ger en lösning på denna fråga genom att ersätta tidigare microtrycktekniker med en ny mikroflödesavsättningsteknik.

Genchi m.fl.. Modifierade PDMS substrat med genipin och found långvarig livskraft myocyter upp till en månad i kultur ^11. Här använder vi en liknande strategi att utöka kultur av mönstrade vaskulära glatta muskelceller på PDMS. Genipin, en naturlig hydrolytisk derivat av gardenia frukt, är en önskvärd kandidat för substrat ändring på grund av dess relativt låg toxicitet jämfört med liknande tvärbindningsmedel och dess ökande användning som biomaterial inom vävnadsreparation ^12,13 och ECM ändring ^{14, 15.} I detta protokoll, är fibronektin utnyttjas som en cell vägledning kö, som i tidigare microtryckmetoder; dock genipin avsätts på PDMS substrat före fibronektin mönstring. Således, som celler försämra mönstrade matrisen, kan nysyntetiserade ECM från anslutna VSMC binda till genipin belagda PDMS substrat.

Detta protokoll använder en mikroflödes avgivningsanordning för två-stegs genipin och ECM nedfall. Utformningen av mikrofluidikanordning härmar microcontact tryckmönster som används för konstruerade arteriell lameller i tidigare studier ^16. Därför räknar vi med detta protokoll för att ge arteriell lameller härmar som framgångsrikt rekapitulera den högt linje in vivo struktur och sammandragande funktion av arteriell lameller. Vi utvärderar också vävnads kontraktilitet att bekräfta att genipin är ett lämpligt substrat modifikation förening för långsiktig in vitro modeller kärlsjukdom.

Protocol

Obs: Målet med detta protokoll är att konstruera och använda en vaskulär muskulös tunn film (vMTF) med den struktur som visas i figur 1 för att bedöma kontraktilitet under förlängd odling av vaskulära glatta muskelceller (VSMC) på PDMS substrat. För att förlänga VSMC lönsamhet, använder vi tvärbindningsföreningen genipin. De substrat för dessa vMTFs är utformade för att analysera vävnads kontraktilitet som utvecklats av Grosberg et al. 8 Övriga vMTF metoder <su…

Representative Results

Det primära målet med detta arbete var att förlänga livskraften hos micropatterned VSMC på hydrofoba PDMS substrat. Detta åstadkoms genom att införliva ett mikrofluidtillförselsystem för att avsätta mönstrade genipin och fibronektin på PDMS (Figur 1). Deponering av ECM-proteiner med hjälp av mikroflödes leverans gav trohet överföring av kanalmönstret hög med nakna PDMS mellan rader av genipin och fibronektin (Figur 1D). De bifogade celler (figur 1E) bildar</str…

Discussion

Här presenterar vi ett protokoll som bygger på tidigare utvecklat vMTF teknik, vilket gör att långa experiment gånger mer typiska för kronisk kärlsjukdom vägar ^1,23,24. För att åstadkomma detta, micropattern vi genipin, som tidigare har visat sig ge långsiktig funktionalisering av PDMS-substrat ^11, med användning av ett mikrofluidavsättningsteknik för erhållande av Engineered arteriell lameller med förbättrad vaskulär vävnadsviabilitet för användning i MTF kontraktilitet experi…

Materials

Coverslip staining rack	Electron Microscopy Sciences	www.emsdiasum.com/	72239-04	Alternative coverslip rack may be used
Microscope cover glass – 25 mm	Fisher Scientific, Inc.	www.fishersci.com	12-545-102	Alternative brand and size may be used; Microscope slides may also be substituted as substrate base
Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	#21458	Sigma-Aldrich makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol; Compound gives strong odor, use proper ventilation
1-butanol	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	360465	Hazard: flammable (store stock solution in flammable cabinet); flash point is 37 °C, avoid heating; alternative product may be used
Spincoater	Specialty Coating Systems, Inc.	www.scscoatings.com		SCS G3P8 Model; Alternative brand and/or model may be used
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives (Dow Corning)	www.ellsworth.com	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Alternative distributor may be used
Fluorescent microbeads	Polysciences, Inc.	www.polysciences.com/	17151	Alternative brand and/or larger size may be used
Silicon wafers	Wafer World, Inc.	www.waferworld.com	2398	Alternative brand and/or size may be used
Photoresist	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 3025 allows 20-25-µm feature height
Contact mask aligner	Suss MicroTec	www.suss.com		MA6 contact mask aligner; alternative brand and/or model may be used for wafer exposure
Developer	MicroChem Corp.	www.microchem.com		SU-8 Developer; Hazard: flammable
Tridecafluro-trichlorosilane	UCT Specialties, Inc.	www.unitedchem.com	T2492	Silane for non-stick coating of patterned silicon wafers (CAUTION: Tridecafluro-trichlorosilane is a flammable and corrosive liquid. Proper personal protective equipment and local exhaust is necessary for use. )
Surgical biopsy punch	Integra LifeSciences Corp.	www.miltex.com	33-31AA-P/25	Alternative brand and/or size may be used
Genipin	Cayman Chemical	www.caymanchem.com	10010622	Sigma-Aldrich (G4796-25MG) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
1X phosphate buffered saline	Mediatech, Inc.	www.cellgro.com	21-031-CV	Alternative brand may be used
Fibronectin	Corning, Inc.	www.corning.com	356008	Sigma-Aldrich (F1056) makes an alternate compound, but we have not tested it for use with this protocol
Penicillin/streptomycin	Life Technologies, Inc.	www.lifetechnologies.com	15140-122	Alternative brand and/or size may be used, as long as concentration is the same
Umbillical artery smooth muscle cells	Lonza	www.lonza.com	CC-2579	Alternative cell types may be used for alternative applications. Media should be modified accordingly
Tyrode's solution components	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	various	Alternative brand may be used for mixing solution
Stereomicroscope	Zeiss	www.zeiss.com	4350020000000000	SteREOLumar V12; Alternative brand/type of stereomicroscope may be used
Temperature-controlled platform	Warner Instruments	www.warneronline.com	641659; 640352; 641922
Endothelin-1	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	E7764-50UG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained
HA-1077	Sigma-Aldrich	www.sigmaaldrich.com	H139-10MG	Alternative amount may be purchased, as long as treatment concentration is maintained